2018 年度実績報告書

神経系を有するiPS細胞由来ヒト型高次肝組織の生体内での再構築

研究課題

研究課題/領域番号	18H02874
研究機関	横浜市立大学
研究代表者	小池直人横浜市立大学, 医学研究科, 客員教授 (50301081)
研究分担者	田所友美横浜市立大学, 医学部, 助教 (20507644) 武部貴則横浜市立大学, 先端医科学研究センター, 教授 (20612625) 谷口英樹横浜市立大学, 医学研究科, 教授 (70292555)
研究期間 (年度)	2018-04-01 – 2021-03-31
キーワード	高次肝組織 / 神経系 / iPS
研究実績の概要	これまでに、ヒトiPS細胞由来の肝前駆細胞(hiPS-HE)、血管内皮細胞(hiPS-EC)、間葉系幹細胞(hiPS-STM)を共培養しvitroで作成した肝芽をマウス内に移植して、障害肝マウスの生存率を向上させるほどの、アルブミン等の合成や代謝機能を有する微小肝組織を作成する事に成功している。今回、さらにhiPS細胞から誘導した神経幹細胞を加え、これまでできていなかった胆汁分泌可能な胆管、および動静脈、神経からなる門脈域を有する微小肝組織構築を試みた。本年度は、これまで通り微小肝組織は構築できるものの、まだ、門脈域を構築するまでには至っていない。培養上清中やマウス血中アルブミン値を、微小肝組織の機能の目安としているが、神経幹細胞をhiPS-STMと同程度加えたところ、かえって機能の低下が認められた。また、hiPS-STMを減量したところ、類洞の形成が明瞭になったが、生存持続時間が減少した。現在、各細胞の割合を変えながらプロトコルの改良中である。また、神経幹細胞の数のみならず、加えるタイミングや、混入法を検討するために、生体肝組織内での門脈域の構築過程を胎生期のマウスから生後早期のマウスを用い組織標本と胆管や血管のマーカーに対する免疫染色を行うことにより再検討してみた。マウスではductal plate内で微小胆管が構築されるのは生まれる直前E17.5で、生後もしばらく門脈域の再構築は続いていき、ほぼ4週に安定することが確認できた。これに加え神経系の構築を神経マーカーPGP9.5の免疫染色で観察した。その結果、胎生期には肝組織内に神経細胞は確認できなかった。E15.5の標本で肝門部胆管周囲に神経線維を確認することができ、生後徐々に肝門近傍の肝実質内に構築された門脈域から末梢に向かって神経線維の密度が上昇していくことが観察された。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由本研究では最終的に動静脈、胆管、神経構造から成る門脈域を有し、胆汁分泌能を持つヒト型高次肝組織の構築を目指している。そのために、これまで肝芽を構築するために用いた細胞ソース、hiPS-HE、hiPS-EC、hiPS-STM以外に神経幹細胞を共培養することを計画した。これまでにhiPSから神経幹細胞を誘導することは可能であったが、これまで報告されているいくつかの分化誘導法でも効率よく増殖性の高い神経幹細胞を分化誘導することが困難であった。しかし、これを改善するためには、論文に記載されていない細かな諸条件などを最適化しながら効率は向上している。また、マウスの実験や文献よりこれまで明らかでなかった肝発生時の肝内神経系の構築過程が徐々に明らかになり、肝門近傍から門脈域が末梢に向けて徐々に構築されていく過程が予測でき、ヒト型高次肝組織の構築の達成に向けて、神経幹細胞の数のみならず、混入のタイミングや、混入方法を検討するきっかけができ順調な進捗であると考えられる。
今後の研究の推進方策	動静脈や、門脈、胆汁分泌が可能な胆管構造を有するヒト型高次肝組織の構築を目指す為に、予定通りhiPS細胞より神経幹細胞の誘導構築を達成する。特にhiPS細胞からの内皮細胞の分化誘導プロトコルにおける課題解決を目指し、クローンの変更、細かな諸条件の検討、他の文献のプロトコルの検討などを実施する。さらにヒトの再生医療への利用を目指すため、改良したプロトコルを基盤に肝芽形成実験を行う。マウス胎生期、および、生後早期の肝を用いた観察から神経線維の肝外から肝門部胆管周囲を経由して肝実質内への侵入が生後の門脈域の構築に関与する可能性が示唆された。しかし、ヒトのabortionの検体を用いたこれまでの文献では胎生期にすでに神経線維が存在している報告もある。これらを踏まえて、今後、肝芽作成時の細胞数の比率を変えて検討するだけでなく、神経幹細胞のシート上に肝芽を植えて神経細胞の肝芽内への迷入をクラニアルウィンドウ内で可視化して観察する実験が必要と考えている。その後に、構築できた微小肝組織でのタンパク質合成機能などの肝機能評価も検討している。