軟骨腫瘍形成過程における変異IDHの時空間的作用の全貌解明

2018 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 18H02929
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 戸口田 淳也 京都大学, ウイルス・再生医科学研究所, 教授 (40273502)
• 研究分担者: 吉富 啓之 京都大学, ウイルス・再生医科学研究所, 准教授 (50402920) ; 金 永輝 京都大学, 医学研究科, 特定助教 (90620344)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: 軟骨肉腫 / IDH遺伝子 / iPS細胞

研究実績の概要

ヒトiPS細胞を用いて軟骨形成腫瘍のドライバー変異である変異IDH遺伝子の腫瘍形成における役割の解明を目指した。iPS細胞に外来遺伝子の発現を誘導する際の課題であるサイレンシングの問題に対して、導入ベクターを改変することによりAAVS1遺伝子座に導入した変異IDH1（R132C及びR132H変異）を長期間安定してドキシサイクリンにより誘導できるiPS細胞(iPS-IDH1)の樹立に成功した。そして、この細胞から中胚葉を経由した分化誘導法により間葉系間質細胞(Mesenchymal stromal cell、MSC)を誘導し、変異IDH1遺伝子の発現を誘導した状態で長期培養を行うことが可能となった。更に付加的遺伝子変異としてp16遺伝子を欠損させるために、CRISPR/Cas9システムを用いて、iPS-IDH1のp16遺伝子の両アレルに機能消失型変異を導入した細胞(iPS-IDH1-p16KO)を作製した。これらの細胞に関して、まず増殖能を解析したところiPS-IDH1-p16wtにおいて変異IDＨを誘導した際には、SA-beta-gal陽性細胞が増加し増殖が抑制されやがて停止したが、iPS-IDH1-p16KOにおいて誘導した場合は、経過に伴いSA-beta-gal陽性細胞は減少し、細胞は増殖しつづけることが判明した。次にiPS-IDH1-p16KOを中胚葉細胞に誘導した後に、IDH1を誘導した際の分化関連遺伝子の発現を解析したところ、これまでに骨髄由来MSCで観察された軟骨関連遺伝子の上昇及びALP遺伝子の発現抑制が観察された。全体のDNAメチル化量も長期間培養後に増加していることが確認され、このシステムが腫瘍形成過程をin vitroで再現できている可能性が示唆された。現在、iPS-IDH1-p16KOの造腫瘍能に関して免疫不全マウスへの移植により検討を進めている。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

課題であったサイレンシングの問題を克服できたことで、長期培養下のおける変異IDHの作用の解析が可能となったことは大きな収穫であり、予定していたエピゲノムの解析が遂行できる状態となった。造腫瘍能の解析のための骨髄内細胞移植モデルの確立に、やや時間を費やしたが、その他は順調に進んでいる。

今後の研究の推進方策

今後は以下の点に関して、研究を進める。
１）iPS-IDH由来の中胚葉細胞の分化能を詳細に解析し、標的遺伝子のエピゲノム解析を行う。
２）iPS-IDH-p16KOの造腫瘍の解析を進める。必要な場合は、第3の変異としてp53遺伝子の変異を導入する。
３）長期培養後のDNAメチル化を網羅的に解析し、変異IDHによって特異的にメチル化が変化している遺伝子群の同定とその腫瘍形成過程における意義を解析する。

研究成果

• [雑誌論文] An mTOR Signaling Modulator Suppressed Heterotopic Ossification of Fibrodysplasia Ossificans Progressiva (2018)
  • 著者名/発表者名: Hino K, Zhao C, Horigome K, Nishio M, Okanishi Y, Nagata S, Komura S, Yamada Y, Toguchida J, Ohta A, Ikeya M
  • 雑誌名: Stem Cell Reports 巻: 11 ページ: 1106-1119
  • DOI: 10.1016/j.stemcr.2018.10.007
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Human Sox4 facilitates the development of CXCL13-producing helper T cells in inflammatory environments (2018)
  • 著者名/発表者名: Yoshitomi H, Kobayashi S, Miyagawa-Hayashino A, Okahata A, Doi K, Nishitani K, Murata K, Ito H, Tsuruyama T, Haga H, Matsuda S, Toguchida J
  • 雑誌名: Nat Commun 巻: 9 ページ: 3762
  • DOI: 10.1038/s41467-018-06187-0
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Modeling human somite development and fibrodysplasia ossificans progressiva with induced pluripotent stem cells (2018)
  • 著者名/発表者名: Nakajima T, Shibata M, Nishio M, Nagata S, Alev C, Sakurai H, Toguchida J, Ikeya M
  • 雑誌名: Development 巻: 145 ページ: 165431
  • DOI: 10.1242/dev.165431
  • 査読あり
• [雑誌論文] Prospective comparison of various radiological response criteria and pathological response to preoperative chemotherapy and survival in operable high-grade soft tissue sarcomas in the Japan Clinical Oncology Group study JCOG0304 (2018)
  • 著者名/発表者名: Tanaka K, Ogawa G, Mizusawa J, Naka N, Kawai A, Takahashi M, Hiruma T, Matsumoto Y, Tsuchiya H, Nakayama R, Hatano H, Emori M, Hosaka M, Yoshida Y, Toguchida J, Abe S, Asanuma K, Yokoyama R, Hiraga H, Yonemoto T, Morii T, Matsumoto S, Nagano A, Yoshikawa H, Fukuda H, Ozaki T, Iwamoto Y
  • 雑誌名: World J Surg Oncol 巻: 16 ページ: 162
  • DOI: 10.1186/s12957-018-1462-y.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Current state of therapeutic development for rare cancers in Japan, and proposals for improvement. (2018)
  • 著者名/発表者名: Kawai A, Goto T, Shibata T, Tani K, Mizutani S, Nishikawa A, Shibata T, Matsumoto S, Nagata K, Narukawa M, Matsui S, Ando M, Toguchida J, Monden M, Heike T, Kimura S, Ueda R
  • 雑誌名: Cancer Sci 巻: 109 ページ: 1731-1737
  • DOI: 10.1111/cas.13568
  • 査読あり
• [学会発表] 軟骨形成性腫瘍における変異型IDHの機能的意義について (2018)
  • 著者名/発表者名: 鎌倉 武史、金 永輝、玉置 さくら、渡辺 真、岡本 健、吉富 啓之、戸口田 淳也
  • 学会等名: 第51回日本整形外科学会 骨・軟部腫瘍学術集会
• [学会発表] In vitroにおける長期的なSS18-SSX融合タンパクの機能評価方法の開発 (2018)
  • 著者名/発表者名: 玉置 さくら、永田 早苗、吉富 啓之、湯川 愛友、宗圓 充、鎌倉 武史、金 永輝、戸口田 淳也
  • 学会等名: 第51回日本整形外科学会 骨・軟部腫瘍学術集会
• [学会発表] 滑膜肉腫におけるFZD10を介したシグナル伝達経路とその生物学的意義の解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 宗圓 充、玉置 さくら、湯川 愛友、鎌倉 武史、金 永輝、岡本 健、吉富 啓之、戸口田 淳也
  • 学会等名: 第51回日本整形外科学会 骨・軟部腫瘍学術集会
• [学会発表] 多能性幹細胞の肉腫研究への応用 (2018)
  • 著者名/発表者名: 戸口田 淳也
  • 学会等名: 第1回日本サルコーマ治療研究学会
  • 招待講演