遺伝性網膜疾患の中型-大型動物モデルの拠点形成と新規治療法開発

2018 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 18H02954
• 研究機関: 三重大学
• 研究代表者: 近藤 峰生 三重大学, 医学系研究科, 教授 (80303642)
• 研究分担者: 杉本 昌彦 三重大学, 医学部附属病院, 講師 (00422874) ; 生杉 謙吾 三重大学, 医学系研究科, 准教授 (10335135) ; 松原 央 三重大学, 医学部附属病院, 講師 (20378409) ; 富田 浩史 岩手大学, 理工学部, 教授 (40302088)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: 動物モデル / 先天停在性夜盲 / イヌ / 遺伝子治療 / ウサギ / 網膜色素変性 / 網膜電図

研究実績の概要

研究代表者は、これまで一貫してウサギやイヌなどの中型-大型動物による独自の遺伝性網膜疾患モデルの作出・発見に従事してきた。本年度（2018年度）の成果の最初として、我々が2015年に発見した完全型先天停在夜盲のイヌモデル(cCSNBイヌ)の原因遺伝子を突き止めて確認し、英文論文として投稿した（現在国際誌にて査読中）。この遺伝子は、当初予想した通り現在ヒトで確認されているcCSNBの原因遺伝子として知られている5つの遺伝子の１つであり、我々のcCSNBイヌがまさにヒトのcCSNBのモデルそのものであることが判明した。この遺伝子は比較的短い遺伝子であり、アデノ随伴ウイルスベクターに搭載することが可能であった。今年度は、この遺伝子を共同研究者である岩手大学理工学部の冨田浩史教授との共同研究により、プラスミドより光感受性遺伝子（ChR2）を切り出したベクターへサブクローニングし、発現用プラスミドを用いて非増殖性アデノ随伴ウイルスを作製することができた。ベクターを３種類の濃度で調整し、これを冷凍保存して硝子体注射による遺伝子治療に用いるための準備が整った。また本年は、三重大学医学部動物実験施設においてイヌ（ビーグル犬）による遺伝子組み替え実験の十分な準備を行った。動物実験施設内にイヌ（ビーグル犬）の遺伝子導入実験およびERGによる機能評価と行動実験が可能な十分な広さのP2A特定飼育区域を確保し、ここに電気生理学的および行動実験の機器を搬入した。そして、正常なビーグル犬において硝子体注射とERG記録、および暗所における行動実験を繰り返し行った。これにより、2019年度に本格的に硝子体注射による遺伝子導入実験を行うことができる環境が整った。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

イヌのような大型動物実験を用いた遺伝子導入実験では、特に実験環境の確保と整備が重要である。その意味で、本年度は飼育施設である北山ラベスと実験施設である三重大学医学部動物実験施設において遺伝子組み替え実験の十分な準備を行うことができた。実験に使用するイヌは北山ラベスにおいて適宜繁殖を行い、常に15匹程度のcCSNBイヌ（ビーグル犬）が確保できるように系統維持を続けている。三重大学医学部動物実験施設においては、十分な広さのP2A特定飼育区域を確保し、ここに電気生理学的および行動実験の機器を搬入した。その後、正常なビーグル犬において硝子体注入とERG記録、および暗所における行動実験を繰り返し行うことができた。これにより、2019年度に本格的に硝子体注射による遺伝子導入実験を行うことができる十分な環境が整った。一方で、共同研究者である岩手大学理工学部の冨田浩史教授は、本研究で硝子体注射するためのアデノ随伴ウイルス（３種類の濃度）を作成することに成功し、冷凍保存によりいつでも三重大学に譲渡することができる状態を整えている。

今後の研究の推進方策

2019年度は、岩手大学から三重大学へウイルスを譲渡し、生後1-2年の成人イヌおよび生後1-3か月の幼児イヌに対し硝子体内へ遺伝子組換えアデノ随伴ウイルスを投与する。ベクターの注射は網膜下注射よりもまずは硝子体内注射で行い、3種類の濃度の注射液を準備する。治療後3か月の段階で網膜を摘出し、cCSNBイヌに正常遺伝子が発現しているかどうかを免疫組織学およびPCRで確認する（分担研究者 杉本）。その後、cCSNBイヌの夜盲症状が改善しているかどうかをERGと暗所行動実験で確認する（分担研究者 生杉、松原）。ERGでは、特に暗順応後の杆体応答b波が確認できるかどうか、また長時間刺激による錐体応答においてON応答が確認できるかどうかが鍵となる。また行動実験では、赤外線カメラを使用して障害物を置いた暗所における歩行の様子が遺伝子治療によって改善したかどうかを録画ビデオによる衝突回数で定量的に確認する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] ISCEV extended protocol for the stimulus-response series for light-adapted full-field ERG (2019)
  • 著者名/発表者名: McCulloch DL, Kondo M, Hamilton R, Lachapelle P, Messias AMV, Robson AG, Ueno S
  • 雑誌名: Doc Ophthalmol 巻: 138 ページ: 205-215
  • DOI: 10.1007/s10633-019-09685-8.
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Clinical preferences and trends of anti-vascular endothelial growth factor treatments for diabetic macular edema in Japan (2019)
  • 著者名/発表者名: Sugimoto M, Tsukitome H, Okamoto F, Oshika T, Ueda T, Niki M, Mitamura Y, Ishikawa H, Gomi F, Kitano S, Noma H, Shimura M, Sonoda S, Sawada O, Ohji M, Harimoto K, Takeuchi M, Takamura Y, Kondo M, Sakamoto T
  • 雑誌名: J Diabetes Investig 巻: 10 ページ: 475-483
  • DOI: 10.1111/jdi.12929
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] CLINICAL COURSE OF PARANEOPLASTIC RETINOPATHY WITH ANTI-TRPM1 AUTOANTIBODY IN JAPANESE COHORT (2019)
  • 著者名/発表者名: Ueno S, Inooka D, Nakanishi A, Okado S, Yasuda S, Kominami T, Sayo A, Morimoto T, Kondo M, Katagiri S, Hayashi T, Terasaki H
  • 雑誌名: Retina 巻: 印刷中 ページ: -
  • DOI: 10.1097/IAE.0000000000002329
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] New clinical ultrahigh-resolution SD-OCT using A-scan matching algorithm (2019)
  • 著者名/発表者名: Matsui Y, Kondo M, Uchiyama E, Mityata R, Matsubara H
  • 雑誌名: Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 巻: 257 ページ: 255-263
  • DOI: 10.1007/s00417-018-4183-6
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Novel mutations in the RS1 gene in Japanese patients with X-linked congenital retinoschisis (2019)
  • 著者名/発表者名: Kondo H, Oku K, Katagiri S, Hayashi T, Nakano T, Iwata A, Kuniyoshi K, Kusaka S, Hiyoshi A, Uchio E, Kondo M, Oishi N, Kameya S, Mizota A, Naoi N, Ueno S, Terasaki H, Morimoto T, Iwaki M, Yoshitake K, Iejima D, Fujinami K, Tsunoda K, Shinoda K, Iwata T
  • 雑誌名: Hum Genome Var 巻: 6 ページ: 3
  • DOI: 10.1038/s41439-018-0034-6
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Scleral buckling versus vitrectomy for young japanese patients with rhegmatogenous retinal detachment in the era of microincision surgery: real-world evidence from a multicentre study in Japan (2019)
  • 著者名/発表者名: Shu I, Ishikawa H, Nishikawa H, Morikawa S, Okamoto F, Sakamoto T, Sugimoto M, Kondo M, Iwasaki M, Kinoshita T, Toibana T, Mitamura Y, Takamura Y, Motohashi R, Shimura M, Sakurai Y, Takeuchi M, Gomi F
  • 雑誌名: Acta Ophthalmol 巻: 印刷中 ページ: -
  • DOI: 10.1111/aos.14050
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Association between Retinal Nerve Fiber Layer Thickness and Eye Fatigue (2019)
  • 著者名/発表者名: Ayaki M, Kuze M, Kondo M, Tsubota K, Negishi K
  • 雑誌名: Biomed Res Int 巻: 2019 ページ: 3014567
  • DOI: 10.1155/2019/3014567
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Central serous chorioretinopathy with and without steroids: A multicenter survey (2019)
  • 著者名/発表者名: Araki T, Ishikawa H, Iwahashi C, Niki M, Mitamura Y, Sugimoto M, Kondo M, Kinoshita T, Nishi T, Ueda T, Kato A, Yasukawa T, Takamura Y, Gomi F.
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 14 ページ: e0213110
  • DOI: 10.1371/journal.pone
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Genotype determination of the OPN1LW/OPN1MW genes: novel disease-causing mechanisms in Japanese patients with blue cone monochromacy. (2018)
  • 著者名/発表者名: Katagiri S, Iwasa M, Hayashi T, Hosono K, Yamashita T, Kuniyoshi K, Ueno S, Kondo M, Ueyama H, Ogita H, Shichida Y, Inagaki H, Kurahashi H, Kondo H, Ohji M, Hotta Y, Nakano T
  • 雑誌名: Sci Rep 巻: 8 ページ: 11507
  • DOI: 10.1038/s41598-018-29891-9
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] A Case of Focal Choroidal Excavation Development Associated with Multiple Evanescent White Dot Syndrome (2018)
  • 著者名/発表者名: Matsubara H, Uchiyama E, Suzuki K, Matsuda Y, Kondo M
  • 雑誌名: Case Rep Ophthalmol 巻: 9 ページ: 388-394
  • DOI: 10.1159/000492747
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Supernormal Flicker ERGs in Eyes With Central Retinal Vein Occlusion: Clinical Characteristics, Prognosis, and Effects of Anti-VEGF Agent (2018)
  • 著者名/発表者名: Miyata R, Kondo M, Kato K, Sugimoto M, Matsubara H, Ikesugi K, Ueno S, Yasuda S, Terasaki H
  • 雑誌名: Invest Ophthalmol Vis Sci 巻: 59 ページ: 5854-5861
  • DOI: 10.1167/iovs.18-25087
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] Supernormal Flicker ERGs in Eyes With Central Retinal Vein Occlusion: Clinical Characteristics, Prognosis, and Effects of Anti-VEGF Agent (2019)
  • 著者名/発表者名: Kondo M
  • 学会等名: Macula Society
  • 国際学会
• [学会発表] Clinical application of multifocal ERG (2018)
  • 著者名/発表者名: Kondo M
  • 学会等名: The 50th Annual Symposium of the International Society for Clinical Electrophysiology of Vision (ISCEV)
  • 国際学会
• [学会発表] upernormal flicker ERGs in eyes with central retinal vein occlusion: Clinical characteristics, prognosis, and effects of anti-VEGF agent (2018)
  • 著者名/発表者名: Kondo M
  • 学会等名: The 11th Joint Meeting of Japan-Korea-China Ophthalmologists
  • 国際学会