| 研究課題/領域番号 |
18H02961
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
寺師 浩人 神戸大学, 医学部附属病院, 教授 (80217421)
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| 研究分担者 |
野村 正 神戸大学, 医学部附属病院, 特命講師 (30529566)
榊原 俊介 神戸大学, 医学研究科, 客員准教授 (50444592)
橋川 和信 神戸大学, 医学部附属病院, 准教授 (90403237)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 光生物学 / 皮膚 / 光受容 / 生体時計 / メラノプシン |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、ヒト皮膚における光受容とその意義を探ることを目的とする。これまでにわれわれはヒト皮膚にOPN4が発現しており、このタンパク質を介して皮膚を構成する細胞（特に線維芽細胞）が外界の光を受容し、これを細胞内シグナルへと変換することを明らかとした。またこれは時計遺伝子の発現調節にも影響することを示した。本研究課題では、中枢性に作られたヒト皮膚の末梢性時計が光によりリセットされるのか、あるいはその逆はあり得るのかを探ることを目的として設定した。
昨年度につづき、Bmal 1の発現をルシフェラーゼアッセイにより検証した。Bmal1プロモーターにルシフェリン遺伝子を結合させたプラスミドベクターを培養細胞に導入し、これをリアルタイムルミノメーターにセットしたのち、経時的にルシフェラーゼ発現量を解析した。昨年に得られた結果と同様、約22時間周期でのリズム形成は認められた。この振幅は1週間程度経過しても認められたが、その時点での細胞は形態が変化していた。細胞密度や培地を交換しないことへの反応と考えられるが、ルシフェラーゼによる発光量はその間、高値に推移する傾向にありながらも振幅幅は小さくなる傾向にあった。これはルシフェラーゼが細胞外に分泌されたのちに崩壊せずに機能し続けるためと考えられる。そこで、short lifeのルシフェラーゼに組み替えることとした。Bmal1プロモーターに対してPCRを行い、short lifeルシフェラーゼを含むベクターへの組み替えを試みたが、プロモーター領域内にGC比率が高く増幅が困難であり、現在、さらに条件を変化させながら研究を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
上記のようにPCRによるプロモーター増幅が困難であり、現在、条件設定を重ねている。ただし、増幅が得られれば速やかに計画に戻れると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
まず、PCRによりBmal1プロモーターの増幅を行い、本領域をshort life luciferaseにbinding させる。次にこのプラスミドベクターを培養細胞に導入し、よりクリアカットな振幅を得る。同様にshort life lucieraseは発光色を変化させることができるため、Per2プロモーターも同様に導入し、doubleでの検討を行う。
これらプラスミドベクターを用いて、皮膚細胞におけるサーカディアンリズムのフェーズシフトの解析を行う。デキサメタゾンで刺激を行い、リズムを形成させたのち、480nm光を照射、リズム変化が生じるのかを検討する。次に480nm光で形成されたサーカディアンリズムに対してデキサメタゾンを添加し、これによりリズム変化が生じるのかを検討する。いずれも暗室下で振動刺激を避けながら行う必要があり、このため、厳密なネガティブコントロールをセッティングする必要がある。
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