| 研究課題/領域番号 |
18H03043
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| 研究機関 | 国立研究開発法人国立環境研究所 |
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研究代表者 |
平野 靖史郎 国立研究開発法人国立環境研究所, 環境リスク・健康研究センター, フェロー (20150162)
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| 研究分担者 |
菅野 さな枝 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 講師 (50391090)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 陽イオン / 表面活性 / 肺 / 生体影響 / 細胞毒性 |
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| 研究実績の概要 |
精製水上にジパルミトイルホスファチジルコリンの単分子膜を展開作製する方法を改良することにより、Wilhelmy法を用いて単分子膜の標準π-A曲線を安定して測定できるようになった。陽イオン界面活性剤の被検物質をトローフ下層に添加したところ、塩化セチルピリジニウムが濃度依存的にジパルミトイルホスファチジルコリンのπ-A曲線のliquid expanded (LE)相の傾きを低下させたことより、サーファクタントの膜崩壊圧を低下させている可能性が示された。また、塩化ベンザルコニウムも同様にπ-A曲線のLE相の傾きを低下させることを確認した。ジパルミトイルホスファチジルコリンの代わりに人工サーファクタントであるサーファクテンを用いて作製した単分子膜においても、同様の結果が得られた。一方、疎水基を持たず界面活性作用のない塩化ピリジニウムは、ジパルミトイルホスファチジルコリンや人工サーファクタントの展開単分子膜のπ-A曲線を変化させなかった。塩化ピリジニウムでは膜の伸縮性を変化させないことより、陽イオン界面活性剤の疎水基部分が肺サーファクタントと強い相互作用をするものと考えられる。これらのことより、陽イオン性界面活性剤は吸入暴露により肺胞表面層に沈着すると、肺胞表面の伸縮性を低下させる可能性が示された。一方、ヒト肺上皮細胞であるA549細胞を使用したin vitro実験において、塩化ベンザルコニウムや塩化セチルピリジニウムの濃度依存的細胞毒性を調べた。細胞毒性が認められない濃度においてもカスパーゼ3/7の活性上昇が認められたことから、陽イオン界面活性剤が細胞にアポトーシスを起こすことが分かった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
塩化ベンザルコニウムや塩化セチルピリジニウムなどの陽イオン界面活性剤の展開単分子膜を人工的に作製して、その界面に及ぼす物理化学的影響をWilhelmy法を用いることにより調べたが、その際、界面活性作用のない塩化ピリジニウムを陰性対照として選択することにより、より定量的な比較を行うことが可能となった。また、ヒト肺上皮細胞であるA549細胞を使用したin vitro系の実験を進めた。今年度は、まず、細胞毒性試験を実施するとともに、細胞死に係わるカスパーゼ等の活性変化をケミルミネッセンス法やイムノブロット法を用いて調べ、塩化ベンザルコニウムや塩化セチルピリジニウムがアポトーシスを起こすことを明らかにできた。被険物質の電荷が重要な実験系においては、培地の緩衝作用が試験結果に大きな影響を及ぼす可能性も否定できないため、気液界面におけるエアロゾル曝露系を作製し、粒子として吸入曝露した場合の陽イオン界面活性剤の細胞への影響を把握する必要があると考えられる。粒子表面の電荷そのものの影響を調べるために、表面修飾された標準粒子を用いて細胞膜と粒子表面との反応性に関する実験を行う準備を進めている。そのため、細胞膜上に貪食レセプターを発現させた細胞を準備しているところである。
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| 今後の研究の推進方策 |
昨年度は、表面張力計を用いて塩化ベンザルコニウムや塩化セチルピリジニウムなどの陽イオン界面活性剤が肺サーファクタントの界面の物理化学的性状に及ぼす影響に加え、ヒト肺上皮細胞であるA549細胞を使用したin vitro系の細胞毒性試験を進めた。今年度は、まず、アポトーシスやパイロプトーシスなど細胞死に係わるカスパーゼ等の変化についてさらに詳細に調べ、陽イオン界面活性剤が細胞に与える作用機序について調べる予定である。培地の緩衝作用が試験結果に大きな影響を及ぼす可能性も否定できないため、気液界面におけるエアロゾル曝露系を作製し、粒子として吸入曝露した場合の陽イオン界面活性剤の細胞への影響を把握する準備を進める。さらに、粒子表面の電荷そのものの影響を調べるために、表面修飾された標準粒子を用いて細胞膜と粒子表面との相互作用や粒子の細胞内取込み機構に関する実験を行う。ジパルミトイルホスファチジルコリンや実際の肺サーファクタントを用いたLangmuir-Blodgett膜の作成とその表面張力性測定、ならびに陽イオン界面活性剤が肺表面活性に及ぼす影響についても引き続き調べる。また、アルキル鎖長が異なる塩化ベンザルコニウム同族体 (例えば、疎水性のカーボン鎖長がC12-, C14-, C16-) を用いて、陽イオン界面活性剤の疎水性鎖長の違いによる細胞毒性の比較等を行う予定である。
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