| 研究課題/領域番号 |
18H03043
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| 研究機関 | 国立研究開発法人国立環境研究所 |
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研究代表者 |
平野 靖史郎 国立研究開発法人国立環境研究所, 環境リスク・健康研究センター, フェロー (20150162)
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| 研究分担者 |
菅野 さな枝 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 講師 (50391090)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 陽イオン / 表面活性 / 肺 / 生体影響 / 細胞毒性 |
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| 研究実績の概要 |
これまでに、ヒト肺上皮細胞であるA549細胞を用いたin vitro実験において、塩化ベンザルコニウムが濃度依存的に細胞毒性やカスパーゼ3/7の活性上昇を起こすことから、陽イオン界面活性剤が細胞にアポトーシスを起こすことを明らかにした。そこで、塩化ベンザルコニウム分子におけるアルキル鎖長が細胞毒性にどのように関与しているかを調べるために、アルキル鎖の炭素数をC-12, C-14, C-16と変えた場合の細胞生存率を調べたところ、C-12とC-14は同程度の細胞毒性を示したが、C-16ではC-12,やC-14に比べて有意に高い細胞毒性を示すことが分かった。また、酸化ストレスを軽減することが知られているN-アセチルシステインは、塩化ベンザルコニウムや塩化セチルピリジニウムの細胞毒性を低減させたが、その効果は限定的であった。一方、粒子状物質の荷電状態を調べるために、動的光散乱法を用いて二酸化チタンならびに酸化亜鉛のゼータ電位を測定した。血清の入った培地中では負に荷電していた粒子の陰性度が緩和されることが分かった。酸化亜鉛は、培地中において比較的すみやかに溶解して亜鉛イオンとして細胞に作用するものと考えられる。二酸化チタンは不溶性であるが、両粒子状物質ともに無血清培地における細胞毒性は著しく上昇したことより、粒子表面におけるタンパク質の吸着が粒子表面のゼータ電位とともに細胞に対する反応性を変化させている可能性を示した。マウスマクロファージであるJ774.1細胞にこれらの粒子を曝露して、オートファジー関連タンパク質の変化を用いて調べた。細胞におけるLC3-IからLC3-IIへの変化やp62/SQSTM量はリソソームの酸性度の低下と共に上昇するが、酸化亜鉛粒子は、リソゾームの機能を変化させることなくLC3-II/LC3-I比やp62/SQSTM量を上昇させることが分かった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
陽イオン界面活性剤が細胞膜へ作用する上において、疎水性部分を形成するアルキル鎖が重要な役割を担ってると考えられる。代表的な陽イオン界面活性剤である塩化ベンザルコニウムのアルキル鎖の炭素数をC-12, C-14, C-16と変化させ、細胞毒性にどのように関与しているかを調べたところ、C-16はC-12,やC-14に比べて有意に高い細胞毒性を示したことより、アルキル鎖の炭素数と陽イオン界面活性剤の生物活性との関係を明らかにした。このことは、類似粒子状物質の生体作用機序を解明する上において重要な知見であると考えている。また、本研究では陽イオン界面活性剤をエアロゾル粒子として吸入曝露した場合を想定しているため、粒子表面の電荷そのものの呼吸器細胞への影響を調べる準備として、粒子の貪食レセプターを発現した細胞の作製や、気液界面における細胞へのエアロゾル曝露方法の開発に関して準備を進めてきたところである。研究を開始して２年が経過したところであるが、これまでに、粒子表面電荷の解析、肺胞表面被覆物質を模擬したLangmuir-Blodgett膜への陽イオン界面活性剤の作用機序の解析、陽イオン界面活性剤のアルキル鎖長と細胞毒性との関係、酸化亜鉛や酸化チタンなどの模擬粒子を用いた粒子が細胞のリソソーム機能に及ぼす影響等に関する研究を順次進め、英文雑誌2報にオンライン印刷されたところである。これらのことより、研究は概ね順調に進展していると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでに、Wilhelmy表面張力計を用いて、塩化ベンザルコニウムや塩化セチルピリジニウムの肺サーファクタントの界面の物理化学的性状に及ぼす影響を綿密に調べてきた。また、ヒト肺上皮細胞であるA549細胞やマウスマクロファージであるJ774.1細胞を使用したin vitro系の細胞毒性に関する研究を進め、一部論文発表を行ったところである。今年度は、陽イオン界面活性剤の細胞膜との反応機構を詳細に調べるために、特にマクロファージの細胞表面に多く発現し粒子貪食に関して重要な役割を担っていると考えられているMacrophage Receptor with Collagenous Structure (MARCO)を発現させた細胞を用いて、粒子の表面電荷と細胞膜との反応性について詳細な研究を進める予定である。また、陽イオン性の化合物が細胞機能に及ぼす影響解明のため、酸性条件下で機能しているオルガネラであるリソソームやオートリソソームに注目した研究も展開する予定である。エアロゾルとして吸入した陽イオン界面活性剤の影響を、in vitro細胞系で構築することは容易ではない。これは、培養細胞の表面がが培養液で覆われているために、エアロゾル粒子が直接細胞に取り込まれる効率が極めて低いからである。そのために、気液界面におけるエアロゾル曝露系の構築を進めてきているところであるが、本年度はエアロゾル化した陽イオン界面活性剤を細胞へ直接曝露し、通常の培養系で得られたこれまでの細胞毒性や細胞機能の変化が、気液界面実験系で得られるかどうか検証する予定である。エアロゾル化した陽イオン界面活性剤が肺表面活性に及ぼす影響についても、肺サーファクタントの主成分であるジパルミトイルホスファチジルコリンを用いて調べる予定である
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