| 研究課題/領域番号 |
18H03552
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| 研究機関 | 東京薬科大学 |
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研究代表者 |
根岸 洋一 東京薬科大学, 薬学部, 准教授 (50286978)
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| 研究分担者 |
吉川 大和 東京薬科大学, 薬学部, 准教授 (20274227)
丸山 一雄 帝京大学, 薬学部, 教授 (30130040)
高橋 葉子 (遠藤葉子) 東京薬科大学, 薬学部, 助教 (30453806)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 超音波 / ゲノム編集 / 筋ジストロフィー |
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| 研究実績の概要 |
平成30年度研究では、デュシャンヌ型筋ジストロフィーモデルマウス(mdx)へのデリバリーシステムを構築を目指すために、以下３項目について検討した。
１．ゲノム編集用ガイドRNA配列の検討：まず最適なゲノム編集法を決定するために標的ジストロフィン遺伝子の変異エクソン（ストップコドン含有）を切り取る手法と変異を修復する手法の選定を行った。方法としてsmall guide RNA（sgRNA）を発現するプラスミドDNA（Cas9タンパク質も発現可能）を用いて、mdx局所筋組織へと導入し、ジストロフィンタンパク質発現を免疫染色法にて比較検討した。結果として、変異を切り取る手法において発現効率が高いことが示された。
２．ゲノム編集ツールの機能性評価：また、同様にゲノム編集ツールの筋組織への導入にRNP（ Cas9タンパク質/sgRNA複合体）あるいはRNA（Cas9 mRNA/sgRNA）のどちらの手法が、編集効率が良いかをmdx局所筋組織へと導入して検討したところ、RNAの状態（Cas9 mRNA/sgRNA）で導入した場合においてジストロフィンタンパク質の発現回復が一部認められた。一方で、RNPの状態ではほとんど発現は認められなかった。以上のことから超音波応答性ナノバブルとの併用法を最適化することでジストロフィンタンパク質発現回復の向上が期待された。
３．光音響イメージング装置を利用したナノキャリア検出のための蛍光標識の選定：光音響イメージング装置を用いて、数種の蛍光試薬で標識したナノキャリアが、どのような波長のものがLED光音響イメージング装置で検出可能かについて検討した。その結果、700nm付近の励起波長を有する蛍光試薬を使うことで、経皮的な検出が可能となることが判明した。一方で570 nm付近の蛍光試薬では、検出不良であることも示された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今年度の検討により、デュシャンヌ型筋ジストロフィーモデルマウス(mdx)におけるジストロフィン遺伝子変異の修復を行うためのゲノム編集用ガイドRNAの有効な配列決定を、mdx筋組織への直接投与により検討し、その後のジストロフィンタンパク質発現回復を評価することで有効配列を決定することに成功した。また、今後、超音波照射との併用によるゲノム編集用ツール搭載ナノ粒子の血管外移行性(筋組織集積性)を評価していくための光音響イメージングの基礎的検討も行うことができた。以上のことから、本研究を順調に進めることができたと考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、デュシャンヌ型筋ジストロフィー疾患治療に向けたゲノム編集ツールの筋組織へのデリバリーシステムの確立を進めて行くために以下の検討を進める予定である。（１）RNAデリバリーのためのナノキャリアの調製と選定：数種のリン脂質とPEG脂質を組み合わせて粒子サイズ、安定性の観点から有用キャリアの調製を図る。（２）超音波を併用するゲノム編集ツールデリバリーシステムの開発：（１）の結果を踏まえ、レポーター遺伝子をコードしたmRNAとキャリアとの組み合わせにより筋組織へと超音波併用導入し、in vivoイメージング装置によりデリバリー効率の最適化を図る。最適条件にてゲノム編集用RNA（Cas9 mRNA/sgRNA）の超音波併用導入を試み、組織学的な評価を行う。本検討ではRNAのみならずゲノム編集用カセットを組み込んだプラスミドDNA（sgRNA・Cas9タンパク質を発現）を用いての検討も行う。（３）ナノキャリアの血管外移行性(筋組織集積性)評価：蛍光標識ナノ粒子の投与後に超音波照射し、in vivoイメージング装置ならびに光音響イメージング装置を用いて、ナノキャリアの血管外移行性(筋組織集積性)を評価する。結果を踏まえ、筋組織移行性向上のための条件検討を進める。
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