| 研究課題/領域番号 |
18H03935
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
菊地 和也 大阪大学, 工学研究科, 教授 (70292951)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 蛋白質ラベル化 / 化学プローブ / 膜蛋白質 / PYPタグ / BLタグ |
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| 研究実績の概要 |
PYPタグラベル化法を用いたGLUT4の機能解析として、細胞膜上に移行したGLUT4を選択的・迅速・高コントラストに可視化するために、膜非透過性で、遊離状態の蛍光が抑制されラベル化されると蛍光強度が強くなる発蛍光プローブの開発を行った。特にマウスを用いた実験への応用を考慮し、近赤外蛍光を示す蛍光色素として、650～700 nmに蛍光発光波長を有するSiローダミン系の色素を選択した。これらの色素にPYPタグリガンド、消光基を導入することで発蛍光プローブを合成した。SDS-PAGE解析により発蛍光プローブのラベル化を確認した。さらに蛍光スペクトル測定により、ラベル化速度、及び発蛍光性を評価したところ、ラベル化が迅速に起こり、大きく蛍光強度が上昇することが明らかとなった。
もう一つの成果として、変異体ベータラクタマーゼ（BL）タグシステムを用いた膜蛋白質の蛍光ラベル化による解析を目的としたラベル化プローブの開発を行った。BLタグに対するより高いラベル化効率と保持能、光耐性を確保するために、BLタグのリガンド部位として、 これまでのベータラクタムからなる基質に加え、ベータラクタマーゼ阻害剤の化学構造を導入したプローブを新たに設計・合成した。近年報告された阻害剤に由来する骨格を有する化学プローブを合成した。ラベル化能を評価したところ、BLタグを迅速にラベル化し、長時間インキュベート後も安定にプローブが保持されていることを確認した。また、このプローブは野生型のベータラクタマーゼをタグとした場合も標的蛋白質を効率よくラベル化できることを確認することができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度の目的である、膜蛋白質をラベル化する新たな蛍光プローブの開発は達成しており、順調に進展しているといえる。また、BLタグを利用したラベル化に関しては、新たなリガンド構造を有するプローブを開発し、優れたラベル可能と保持性能を示すことを明らかにすることができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
PYPタグラベル化法を用いたGLUT4の機能解析においては、細胞膜上に移行したGLUT4の膜局在維持機構を解明するため、GLUT4にラベル化した近傍の分子を捉える新たなプローブを開発する。このプローブは、細胞膜非透過性の蛍光性PYPタグリガンドとビオチンからなっており、PYP-GLUT4を発現させた細胞に対しプローブのラベル化後、市販のクロスリンク剤で処理を行い、蛋白質同士を架橋させる。膜蛋白質を可溶化し、ビオチン-ストレプトアビジンの相互作用を利用してGLUT4が結合した分子を特異的に濃縮する。得られた蛋白質をSDS-PAGEにより解析し比較する。Trypsin消化後にMS/MS解析を行い、標的蛋白質を同定する。
BLタグを用いた膜蛋白質動態の解析においては、新たに開発したプローブを用い、細胞外の脂質ラフトに局在が見られるGPIアンカーの付いた膜蛋白質をラベル化し、イメージングを行う。また、細胞膜内葉の膜蛋白質をラベルするためには、プローブが細胞膜を透過する必要がある。現状のプローブでは膜透過性を有していないため、細胞内で分解可能なエステル構造を導入するなどの改変を加える。この改変されたプローブを用いて免疫系の膜蛋白質であるToll様受容体4（TLR4）とアダプター蛋白質（TIRAP）をそれぞれ近赤外と赤色で染め分けてラベル化、解析できるかどうかを検証する。
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