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2020 年度 実績報告書

化学アプローチによる膜蛋白質の動的解析

研究課題

研究課題/領域番号 18H03935
研究機関大阪大学

研究代表者

菊地 和也  大阪大学, 工学研究科, 教授 (70292951)

研究期間 (年度) 2018-04-01 – 2021-03-31
キーワード化学プローブ / 蛋白質ラベル化 / GLUT4 / PYPタグ / β-ラクタマーゼタグ
研究実績の概要

本研究ではPYPタグを用い、グルコース取り込みに関与する膜蛋白質GLUT4の機能解析を目的としている。今年度は細胞膜上に移行したGLUT4の膜局在維持機構を解明するため、GLUT4にラベル化した近傍の分子を捉える新たなプローブの開発に取り組んだ。プローブとして、細胞膜非透過性のPYPタグリガンドとビオチンを有する分子を設計した。ビオチンの導入により、ストレプトアビジンを用いた蛋白質の回収や解析が容易になると考えた。設計したプローブを合成し、PYPをGLUT4の細胞膜側に面するループ上に提示させた融合蛋白質(PYP-GLUT4)を発現させた細胞に対しラベル化を行った。ストレプトアビジンで標識しSDS-PAGEならびにイメージングにより、PYPのラベル化が行われていることを確認した。続いて市販のクロスリンク剤により、蛋白質同士を架橋させた後に、蛋白質を可溶化し、ビオチン-ストレプトアビジンの相互作用を利用してPYP-GLUT4 が結合した蛋白質を特異的に回収、濃縮した。SDS-PAGEによる解析より、PYP-GLUT4が発現した細胞特異的に新たな蛋白質由来のバンドが確認できた。
また、BLタグを用いた膜蛋白質動態の解析においては、新たに開発したプローブを細胞膜内葉に発現する蛋白質のラベル化に適用するために、細胞膜透過性のラベル化プローブの開発に着手した。リガンドとして用いているβラクタマーゼ阻害剤にはスルホン酸が導入されているため、そのままでは細胞膜透過性を有していない。そこで、スルホン酸部位を近年報告されたプロドラッグに用いられるカルボン酸エステルに置き換えたプローブを設計、合成した。カルボン酸エステルを有するプローブは細胞内透過性を持ち、中性緩衝液中で自発的に分解が起こり、カルボン酸へと変換されることが確認された。このプローブにより細胞内蛋白質のラベル化に成功した。

現在までの達成度 (段落)

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

  • 研究成果

    (16件)

すべて 2022 2021 2020

すべて 雑誌論文 (13件) (うち国際共著 6件、 査読あり 13件、 オープンアクセス 7件) 学会発表 (1件) (うち国際学会 1件、 招待講演 1件) 図書 (1件) 産業財産権 (1件)

  • [雑誌論文] カテプシン K 活性の検出を目指した Off-On スイッチング 19F MRI ナノプローブの開発2022

    • 著者名/発表者名
      小西祐輝、杉原文徳、蓑島維文、菊地和也
    • 雑誌名

      日本分子イメージング学会機関誌(JSMI Report)

      巻: 15 ページ: 29~33

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Cardioluminescence in Transgenic Zebrafish Larvae: A Calcium Imaging Tool to Study Drug Effects and Pathological Modeling2021

    • 著者名/発表者名
      Vicente Manuel、Salgado-Almario Jussep、Collins Michelle M.、Martinez-Sielva Antonio、Minoshima Masafumi、Kikuchi Kazuya、Domingo Beatriz、Llopis Juan
    • 雑誌名

      Biomedicines

      巻: 9 ページ: 1294~1294

    • DOI

      10.3390/biomedicines9101294

    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] Anti-Siglec-15 antibody suppresses bone resorption by inhibiting osteoclast multinucleation without attenuating bone formation2021

    • 著者名/発表者名
      Tsukazaki Hiroyuki、Kikuta Junichi、Ao Tomoka、Morimoto Akito、Fukuda Chie、Tsuda Eisuke、Minoshima Masafumi、Kikuchi Kazuya、Kaito Takashi、Ishii Masaru
    • 雑誌名

      Bone

      巻: 152 ページ: 116095~116095

    • DOI

      10.1016/j.bone.2021.116095

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Development of Off-On Switching 19F MRI Probes for Cathepsin K Activity Detection2021

    • 著者名/発表者名
      Konishi Yuki、Okunishi Atsuya、Sugihara Fuminori、Nakamura Tatsuya、Akazawa Kazuki、Minoshima Masafumi、Kikuchi Kazuya
    • 雑誌名

      Bulletin of the Chemical Society of Japan

      巻: 94 ページ: 1690~1694

    • DOI

      10.1246/bcsj.20210099

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Near-infrared fluorescent probes: a next-generation tool for protein-labeling applications2021

    • 著者名/発表者名
      Reja Shahi Imam、Minoshima Masafumi、Hori Yuichiro、Kikuchi Kazuya
    • 雑誌名

      Chemical Science

      巻: 12 ページ: 3437~3447

    • DOI

      10.1039/D0SC04792A

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Optical Manipulation of Subcellular Protein Translocation Using a Photoactivatable Covalent Labeling System2021

    • 著者名/発表者名
      Kowada Toshiyuki、Arai Keisuke、Yoshimura Akimasa、Matsui Toshitaka、Kikuchi Kazuya、Mizukami Shin
    • 雑誌名

      Angewandte Chemie International Edition

      巻: 60 ページ: 11378~11383

    • DOI

      10.1002/anie.202016684

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Fluorogenic probes for detecting deacylase and demethylase activity towards post-translationally-modified lysine residues2021

    • 著者名/発表者名
      Hori Yuichiro、Nishiura Miyako、Tao Tomomi、Baba Reisuke、Bull Steven D.、Kikuchi Kazuya
    • 雑誌名

      Chemical Science

      巻: 12 ページ: 2498~2503

    • DOI

      10.1039/D0SC06551J

    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] A step towards gadolinium-free bioresponsive MRI contrast agent2021

    • 著者名/発表者名
      Wyskocka-Gajda Marzena、Przypis Lukasz、Olesiejuk Monika、Krawczyk Tomasz、Kuznik Anna、Nawara Krzysztof、Minoshima Masafumi、Sugihara Fuminori、Kikuchi Kazuya、Kuznik Nikodem
    • 雑誌名

      European Journal of Medicinal Chemistry

      巻: 211 ページ: 113086~113086

    • DOI

      10.1016/j.ejmech.2020.113086

    • 査読あり / 国際共著
  • [雑誌論文] Single-cell dynamics of pannexin-1-facilitated programmed ATP loss during apoptosis2020

    • 著者名/発表者名
      Imamura Hiromi、Sakamoto Shuichiro、Yoshida Tomoki、Matsui Yusuke、Penuela Silvia、Laird Dale W、Mizukami Shin、Kikuchi Kazuya、Kakizuka Akira
    • 雑誌名

      eLife

      巻: 9 ページ: e61960

    • DOI

      10.7554/eLife.61960

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Oxygen Functional Groups on MWCNT Surface as Critical Factor Boosting T2 Relaxation Rate of Water Protons: Towards Improved CNT-Based Contrast Agents2020

    • 著者名/発表者名
      Tomczyk Mateusz Michal、Boncel Slawomir、Herman Artur、Krawczyk Tomasz、Jakobik-Kolon Agata、Pawlyta Miroslawa、Krzywiecki Maciej、Chrobak Artur、Minoshima Masafumi、Sugihara Fuminori、Kikuchi Kazuya、Kuznik Nikodem
    • 雑誌名

      International Journal of Nanomedicine

      巻: Volume 15 ページ: 7433~7450

    • DOI

      10.2147/IJN.S257230

    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] A Photodeactivatable Antagonist for Controlling CREB-Dependent Gene Expression2020

    • 著者名/発表者名
      Imoto Takuma、Minoshima Masafumi、Yokoyama Tatsushi、Emery Ben P.、Bull Steven D.、Bito Haruhiko、Kikuchi Kazuya
    • 雑誌名

      ACS Central Science

      巻: 6 ページ: 1813~1818

    • DOI

      10.1021/acscentsci.0c00736

    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] An Acid‐Activatable Fluorescence Probe for Imaging Osteocytic Bone Resorption Activity in Deep Bone Cavities2020

    • 著者名/発表者名
      Hashimoto Ryu、Minoshima Masafumi、Kikuta Junichi、Yari Shinya、Bull Steven D.、Ishii Masaru、Kikuchi Kazuya
    • 雑誌名

      Angewandte Chemie International Edition

      巻: 59 ページ: 20996~21000

    • DOI

      10.1002/anie.202006388

    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] Development of Photoswitchable Fluorescent Molecules Using Arylazopyrazole2020

    • 著者名/発表者名
      Torii Kenji、Hori Yuichiro、Watabe Keiichiro、Kikuchi Kazuya
    • 雑誌名

      Bulletin of the Chemical Society of Japan

      巻: 93 ページ: 821~824

    • DOI

      10.1246/bcsj.20200077

    • 査読あり
  • [学会発表] Nano-particle based 19F MRI contrast agent with tunable chemical switches2021

    • 著者名/発表者名
      Kazuya Kikuchi
    • 学会等名
      Pacifichem 2021
    • 国際学会 / 招待講演
  • [図書] 先端の分析法 第2版(原理編第3章プローブ, MRIプローブ)2022

    • 著者名/発表者名
      蓑島維文、菊地和也
    • 総ページ数
      1072
    • 出版者
      エヌ・ティー・エス
    • ISBN
      978-4-86043-737-4
  • [産業財産権] ケージド化合物から化合物を放出させる方法2021

    • 発明者名
      蓑島維文、橋本 龍、菊地和也
    • 権利者名
      蓑島維文、橋本 龍、菊地和也
    • 産業財産権種類
      特許
    • 産業財産権番号
      特願2021-022014

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公開日: 2022-12-28  

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