| 研究課題/領域番号 |
18H03936
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
片山 佳樹 九州大学, 工学研究院, 教授 (70284528)
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| 研究分担者 |
馬場 英司 九州大学, 医学研究院, 教授 (00315475)
浅井 大輔 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 講師 (10423485)
森 健 九州大学, 工学研究院, 准教授 (70335785)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 細胞膜抗原 / フローサイトメトリー / 蛍光分子プローブ / コンパニオン診断 / 酵素基質 |
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| 研究実績の概要 |
細胞膜抗原検出における増感システム開発について、β‐ガラクトシダーゼ応答型プローブの分子構造の最適化を行い、EGFR検出において、常法の数十倍の増感を達成した。
しかしながら、これらの検出において、細胞内に蓄積した分子プローブの蛍光シグナルが時間とともに減衰することが分かり、その原因を調査したところ、分子プローブが再度、細胞外に離脱することが分かり、さらにはこれが周辺細胞への非特異吸着の原因になる可能性を見出した。そこで、細胞からの離脱を抑制するため、一旦細胞内に蓄積した後に、細胞膜透過性が小さいアニオン性に転換できる分子を設計した。すなわち、フルオレセインの２つの水酸基をアセチル化して、さらにこうれに疎水基を導入して、β‐ガラクトースを2分子導入したプローブを設計・合成した。この分子では、β‐ガラクトシダーゼによりガラクトシル基が切除されると細胞膜に結合して細胞内に挿入され、膜直下でエステラーゼによってアセチル基が加水分解されてアニオン性となることで、受動的な膜への再分配が抑制できる。この分子では、評価の結果、確かに自発的な膜への分配が改善したが、今度は、細胞膜上に存在するアニオントランスポーターにより細胞外にくみ出されることが分かった。アニオントランスポーター阻害剤を併用すると、これらの問題は大きく改善できたが、細胞からの離脱は完全ではなかった。
そこで、次に標的分子に結合する抗体に標識した酵素により反応を受けた後、細胞膜、あるいは細胞質のタンパク質と速やかに反応できるタイプのプローブを種々設計・合成して評価したところ、最適化に成功し、細胞からの離脱や、周辺細胞への非特異結合をほぼ完全に抑制できる増感型分子プローブの開発に成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
当初は、初年度に分子の最適化のための分子プローブを種々合成し、その基礎評価から最適な分子構造と、検出条件を決定するための基本情報を収集することを予定していたが、すでに、実用性のある蛍光プローブの取得に成功し、企業とも商品化の話が進んでいる。このように、計画を前倒しして、実用性のあるシステムを構築できており、計画以上に進展していると言える。
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| 今後の研究の推進方策 |
初年度に、最適な蛍光分子プローブと、その分子設計に必要な条件を見出したので、今後は、この分子プローブを用いて、これまで不可能とされてきた重要な検出対象となりうる膜抗原の検出に挑戦する。まずは、オプジーボの標的分子PD-1が結合するがん細胞上の分子である、PD-L1の検出に挑戦する。すなわち、A549肺がん細胞などを用いて、インターフェロンγ刺激で、PD-L1を誘導し、これを開発したシステムで検出して、常法と比較することで、その有用性を実証する。また、その後、実際に臨床サンプルへ適用して、コンパニオン診断の可能性を評価する。
さらに、この原理を他の色調の蛍光プローブに適用できる一般的分子設計を進めて、実用的多色型膜抗原検出システムを実現し、有効なコンパニオン診断の基礎を確立していく。そのためには、タンパクとの反応性を保持する分子ユニットを他の蛍光分子に連結する、あるいは、蛍光分子構造そのものに組み込むなどの方針で、数種の分子を設計・合成してその基礎評価を行う。
また、多色化のための、新規な酵素の探索も実施していく。
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