家畜繁殖向上に資する排卵・卵胞発育制御を担うエストロゲンフィードバック機構の解明

2020 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 18H03973
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 束村 博子 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (00212051)
• 研究分担者: 松田 二子 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 准教授 (10608855) ; 大蔵 聡 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (20263163) ; 平林 真澄 生理学研究所, 行動・代謝分子解析センター, 准教授 (20353435) ; 上野山 賀久 名古屋大学, 生命農学研究科, 准教授 (70324382)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: キスペプチン / GPR54 / GnRH / メタスチン / エストロゲン

研究実績の概要

本研究は、哺乳類メスにおける「卵胞発育」と「排卵」を制御する弓状核および前腹側室周囲核（AVPV、種によっては視索前野）のキスペプチンニューロンへのエストロゲンのフィードバック機構に着目し、卵胞発育を支配する負のフィードバック、および排卵を支配する正のフィードバックによる性腺刺激ホルモン分泌放出ホルモン（GnRH）/性腺刺激ホルモン分泌制御の分子メカニズムの解明とその応用の検証を目的とする。本年度の研究により、以下の成果を得た。
キスペプチン遺伝子（Kiss1）-floxedマウス・ラットを作成し、エストロゲンの負のフィードバック部位である弓状核特異的にKiss1のノックアウト（KO）を行い、同キスペプチンニューロンが卵胞発育中枢であることを証明した。また、ヒストン修飾蛋白RBBP7がKiss1発現に促進的であることを明らかにした。また、キスペプチンニューロンに発現する受容体探索により得たGPCR候補であるGPR101のリガンドGnRH(1-5)が、同ニューロンに作用してGnRH/LH分泌を促進することを明らかにした。また、低栄養モデルラットにおいて、エストロゲン依存性に室傍核ダイノルフィン（Dyn）ニューロンが活性化し、弓状核キスペプチンニューロンに発現するDyn受容体を介してLHパルスを抑制することを証明した。さらに、反芻家畜モデルのヤギを用いて、脳内へのニューロキニンB投与が弓状核キスペプチンニューロンに作用し、GnRH/LHパルスを促進すること、また脳内へのカルシトニン受容体リガンド（アミリン）の投与がGnRH/LHパルスジェネレータ（弓状核キスペプチンニューロン）の活動を短期的には促進、長期的には抑制することを明らかにした。加えて、ヤギ弓状核および視索前野キスペプチンニューロン由来不死化細胞株を確立し、今後のin vitro実験に資する結果を得た。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

本年度の研究実施により、17報の原著論文および2報の総説・著書（全て査読有）を発表し、研究計画よりも極めて大きな進展があった。以下が進捗の概要である。
コンディショナルKiss1 KOマウス・ラットによる卵胞発育中の証明： Kiss1-floxedマウス・ラットを作成し、弓状核特異的にKiss1のKOを行い、弓状核KISSニューロンが卵胞発育中枢であることを証明した（Ikegamiら, 2020; Minabeら, 2020; Nagaeら, 2021）。生殖中枢キスペプチン（KISS）ニューロンにおけるRBBP7の役割：KISSニューロンにおいて、ヒストン修飾蛋白RBBP7がKiss1発現に促進的に作用することを示した（Horihataら, 2020）。生殖中枢KISSニューロンに発現する受容体の制御機序：ラットKISSニューロンに発現するGPR101のリガンドGnRH(1-5)の脳内投与が、LH分泌を促進することを明らかにした（Iedaら, 2020）。低栄養によるLHパルスの抑制が室傍核ダイノルフィンニューロンに仲介されることを証明した（Tsuchidaら, 2020）。ヤギ（反芻家畜モデル）を用いたキスペプチンニューロンに発現する受容体の役割：ヤギ脳内へのカルシトニン受容体リガンドの投与がGnRH/LHパルスジェネレータの活動を短期的には促進、長期的には抑制することを発見した（Kitagawaら, 2020）。またニューロキニンBが、GnRHパルスを促進的に制御することを証明した（Sasakiら , 2020）。ヤギキスペプチンニューロン由来の不死化細胞株の樹立：ヤギ弓状核および視索前野KISSニューロン由来不死化細胞株を確立した（Suetomiら, 2020; Ohshimoら, 2020）。

今後の研究の推進方策

本年度は、本研究課題の推進で蓄積した成果を多数の論文として公表できた。今後は、特に弓状核キスペプチンニューロン (卵胞発育中枢)、およびAVPVキスペプチンニューロン (排卵中枢) において、特異的に発現することを確認したが、機能が未解明である他のエピジェネティック制御候補因子やエストロゲン受容体共役コファクター等の機能解析を実施する。具体的には、本研究で得られた不死化キスペプチンニューロン株を用いて、候補因子のKiss1遺伝子発現への効果を検証する予定である。また、上記２群のキスペプチンニューロンに発現する機能が未解明の受容体（GPCRなど）について、候補リガンドのキスペプチン放出効果を、in vitroで細胞内カルシウム濃度への効果を確認し検証する。さらに、候補リガンドをin vivoにて、ラットやヤギ脳内に投与しGnRH分泌の指標であるLH分泌への効果を検証するとともに、候補因子のヤギ弓状核キスペプチンニューロン（GnRHパルスジェネレータ）活動への効果を検証する予定である。加えて、本研究の実施により、キスペプチンニューロンを常時可視化した遺伝子改変ラットの作製に成功し、エストロゲンによってKiss１発現が抑制された弓状核キスペプチンニューロンや、エストロゲンがないため同定できなかったAVPVの同ニューロンを可視化する事が可能となったことから、エストロゲンの有無によってキスペプチンニューロン内で発現が増減する遺伝子を解析し、得られた候補因子が、弓状核やAVPVのキスペプチンニューロンに対するエストロゲンフィードバック効果を仲介するかを探索する予定である。さらに、ラットモデルで得られたKiss1遺伝子発現やキスペプチン分泌を制御する候補因子に関する知見を、ヤギ、ウシに応用できるかを検証する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Direct evidence that KNDy neurons maintain gonadotropin pulses and folliculogenesis as the GnRH pulse generator (2021)
  • 著者名/発表者名: Nagae Mayuko、Uenoyama Yoshihisa、Okamoto Saki、Tsuchida Hitomi、Ikegami Kana、Goto Teppei、Majarune Sutisa、Nakamura Sho、Sanbo Makoto、Hirabayashi Masumi、Kobayashi Kenta、Inoue Naoko、Tsukamura Hiroko
  • 雑誌名: Proceedings of the National Academy of Sciences 巻: 118 ページ: e2009156118
  • DOI: 10.1073/pnas.2009156118
  • 査読あり
• [雑誌論文] Estrogen increases KISS1 expression in newly generated immortalized KISS1-expressing cell line derived from goat preoptic area. (2021)
  • 著者名/発表者名: Oshimo, Y., Munetomo, A., Magata, F., Suetomi, Y., Sonoda, S., Takeuchi, Y., Tsukamura, H., Ohkura, S., Matsuda, F.
  • 雑誌名: J Reprod Dev. 巻: 67(1) ページ: 15-23
  • DOI: 10.1262/jrd.2020-053
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Reduction of arcuate kappa-opioid receptor-expressing cells increased luteinizing hormone pulse frequency in female rats. (2021)
  • 著者名/発表者名: Dai, M., Nakamura, S., Takahashi, C., Sato, M., Munetomo, A., Magata, F., Uenoyama, Y., Tsukamura, H., Matsuda, F.
  • 雑誌名: Endocrine Journal 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1507/endocrj.EJ20-0832.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] The neuroendocrine regulation of the mammalian production. (2021)
  • 著者名/発表者名: Tsukamura, H.
  • 雑誌名: General and Comparative Endocrinology 巻: - ページ: -
  • 査読あり
• [雑誌論文] Effect of diet-induced obesity on Kiss1/Tac3/Pdyn gene expressions in the arcuate nucleus and luteinizing hormone secretion in sex hormone-primed male and female rats. (2021)
  • 著者名/発表者名: Minabe, S., Iwata, K., Tsuchida, H., Tsukamura, H., Ozawa, H.
  • 雑誌名: Peptides 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1016/j.peptides.2021.170546.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Testosterone regulation on quiescin sulfhydryl oxidase 2 synthes. (2021)
  • 著者名/発表者名: Wang, T.-E., Minabe, S., Matsuda, F., Li, S.-H., Tsukamura, H., Maeda, K.-I., Smith, L., O'Hara, L., Gadella, B. M., Tsai, P.-S.
  • 雑誌名: Reproduction 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1530/REP-20-0629
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Retinoblastoma binding protein 7 is involved in Kiss1 mRNA upregulation in rodents. (2020)
  • 著者名/発表者名: Horihata K, Inoue N, Uenoyama Y, Maeda KI, Tsukamura H.
  • 雑誌名: J Reprod Dev. 巻: 66(2) ページ: 125 - 133
  • DOI: 10.1262/jrd.2019-149. Epub 2020 Jan 19.PMID: 31956172
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Seasonal changes in the reproductive performance in local cows receiving artificial insemination in the Pursat province of Cambodia. (2020)
  • 著者名/発表者名: Bengthay Tep, Yasuhiro Morita, Shuichi Matsuyama, Satoshi Ohkura, Naoko Inoue, Hiroko Tsukamura, Yoshihisa Uenoyama, Vutha Pheng.
  • 雑誌名: Asian-Australasian Journal of Animal Sciences 巻: 33(12) ページ: 1922-1929
  • DOI: 10.5713/ajas.19.0893
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] GnRH(1-5), a metabolite of gonadotropin-releasing hormone, enhances luteinizing hormone release via activation of kisspeptin neurons in female rats. (2020)
  • 著者名/発表者名: Ieda N, Assadullah, Minabe S, Ikegami K, Watanabe Y, Sugimoto Y, Sugimoto A, Kawai N, Ishii H, Inoue N, Uenoyama Y, Tsukamura H
  • 雑誌名: Endocrine J 巻: 67(4) ページ: 409 - 418
  • DOI: 10.1507/endocrj.EJ19-0444
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Establishment of immortalised cell lines derived from female Shiba goat KNDy and GnRH neurones (2020)
  • 著者名/発表者名: Suetomi Y, Tatebayashi R, Sonoda S, Munetomo A, Matsuyama S, Inoue N, Uenoyama Y, Takeuchi Y,Tsukamura H, Ohkura S, Matsuda F.
  • 雑誌名: J Neuroendocrinol. 巻: 32(6) ページ: 12857
  • DOI: 10.1111/jne.12857
  • 査読あり
• [雑誌論文] Inducible Kiss1 knockdown in the hypothalamic arcuate nucleus suppressed pulsatile secretion of luteinizing hormone in male mice. (2020)
  • 著者名/発表者名: Minabe S, Nakamura S, Fukushima E, Sato M, Ikegami K, Goto T, Sanbo M, Hirabayashi M, Tomikawa J, Imamura T, Inoue N, Uenoyama Y, Tsukamura H, Maeda KI, Matsuda F.
  • 雑誌名: J Reprod Dev 巻: 66(4) ページ: 369 - 375
  • DOI: 10.1262/jrd.2019-164
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Peripheral administration of SB223412, a selective neurokinin-3 receptor antagonist, suppresses pulsatile luteinizing hormone secretion by acting on the gonadotropin-releasing hormone pulse generator in estrogen-treated ovariectomized female goats (2020)
  • 著者名/発表者名: Sasaki T, Sonoda T, Tatebayashi R, Kitagawa Y, Oishi S, Yamamoto K, Fujii N, Inoue N, Uenoyama Y, Tsukamura H, Maeda KI, Matsuda F, Morita Y, Matsuyama S, Ohkura S.
  • 雑誌名: J Reprod Dev 巻: 66(4) ページ: 351 - 357
  • DOI: 10.1262/jrd.2019-145
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Conditional kisspeptin neuron-specific Kiss1 knockout with newly generated Kiss1-floxed and Kiss1-Cre mice replicates a hypogonadal phenotype of global Kiss1 knockout mice. (2020)
  • 著者名/発表者名: Ikegami K, Goto T, Nakamura S, Watanabe Y, Sugimoto A, Majarune S, Horihata K, Nagae M, Tomikawa J, Imamura T, Sanbo M, Hirabayashi M, Inoue N, Maeda KI, Tsukamura H, Uenoyama Y.
  • 雑誌名: J Reprod Dev 巻: 66(4) ページ: 359 - 367
  • DOI: 10.1262/jrd.2020-026
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Testosterone supplementation rescues spermatogenesis and in vitro fertilizing ability of sperm in Kiss1 knockout mice. (2020)
  • 著者名/発表者名: T. Goto, M. Hirabayashi, Y. Watanabe, M. Sanbo, K. Tomita, N. Inoue, H. Tsukamura, Y. Uenoyama.
  • 雑誌名: Endocrinology 巻: 161(9) ページ: 1-11
  • DOI: 10.1210/endocr/bqaa092
  • 査読あり
• [雑誌論文] Mating-induced increase in Kiss1 mRNA expression in the anteroventral periventricular nucleus prior to an increase in LH and testosterone release in male rats. (2020)
  • 著者名/発表者名: Youki Watanabe, Kana Ikegami, Sho Nakamura, Yoshihisa Uenoyama, Hitoshi Ozawa, Kei-Ichiro Maeda, Hiroko Tsukamura, Naoko Inoue
  • 雑誌名: J Reprod Dev 巻: 66(6) ページ: 579-586
  • DOI: 10.1262/jrd.2020-067
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Facilitatory and inhibitory role of central amylin administration in the regulation of the gonadotropin-releasing hormone pulse generator activity in goats . (2020)
  • 著者名/発表者名: Yuri Kitagawa, Takuya Sasaki, Reika Suzumura, Ai Morishima, Ryoki Tatebayashi, Assadullah, Nahoko Ieda, Yasuhiro Morita, Shuichi Matsuyama, Naoko Inoue, Yoshihisa Uenoyama, Hiroko Tsukamura, Satoshi Ohkura.
  • 雑誌名: Neuroscience Letters 巻: 736 ページ: 135276 - 135276
  • DOI: 10.1016/j.neulet.2020.135276.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Paraventricular dynorphin A neurons mediate LH pulse suppression induced by hindbrain glucoprivation in female rats. (2020)
  • 著者名/発表者名: Hitomi Tsuchida, Parvin Mostari, Koki Yamada, Sae Miyazaki, Yuki Enomoto, Naoko Inoue, Yoshihisa Uenoyama, Hiroko Tsukamura.
  • 雑誌名: Endocrinology 巻: 161(11) ページ: 1-18
  • DOI: 10.1210/endocr/bqaa161
  • 査読あり
• [雑誌論文] Establishment of long-term chronic recording technique of in vivo ovarian parenchymal temperature in Japanese Black cows. (2020)
  • 著者名/発表者名: Morita, Y., Ozaki, R., Mukaiyama, A., Sasaki, T., Tatebayashi, R., Morishima, A., Kitagawa, Y., Suzumura, R., Abe, R., Tsukamura, H., Matsuyama, S. and Ohkura, S.
  • 雑誌名: Journal of Reproduction and Development 巻: 66(3) ページ: 271-275
  • DOI: 10.1262/jrd.2019-097
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Generation of Genetically Modified Rats for Analysis of Neural Mechanism Involved in GnRH Pulse Generation. (2021)
  • 著者名/発表者名: Mayuko Nagae, Toshihiro Kobayashi, Makoto Sanbo, Masumi Hirabayashi, Naoko Inoue, Hiroko Tsukamura, Yoshihisa Uenoyama
  • 学会等名: 2020年度GTR成果報告会
• [学会発表] 低栄養による生殖機能抑制は室傍核ダイノルフィンニューロンによる弓状核キスペプチンニューロンの抑制によって仲介される (2020)
  • 著者名/発表者名: 土田 仁美，井上 直子，上野山 賀久，束村 博子
  • 学会等名: 第113回日本繁殖生物学会
• [学会発表] 室傍核ダイノルフィンニューロンがグルコース利用阻害による生殖機能抑制を仲介する (2020)
  • 著者名/発表者名: 土田 仁美，井上 直子，上野山 賀久，束村 博子
  • 学会等名: 第25回日本生殖内分泌学会
• [学会発表] アデノ随伴ウイルスベクター法を介した効率的なTfap2c-T2A-tdTomatoノックインラット作製とその発現解析 (2020)
  • 著者名/発表者名: 長江麻佑子、及川真実、水野直彬、岩月研祐、三宝誠、中内啓光、平林真澄、小林俊寛
  • 学会等名: 第67回日本実験動物学会総会
• [学会発表] 遺伝子改変ラットを用いた卵胞発育中枢の同定 (2020)
  • 著者名/発表者名: 長江麻佑子、上野山賀久、井上直子、小林憲太、平林真澄、束村博子
  • 学会等名: 第10回名古屋大学医学系研究科・生理学研究所合同シンポジウム
• [学会発表] ATP-プリン受容体シグナリングによるAVPVキスペプチンニューロン由来不死化細胞株活性化の検討 (2020)
  • 著者名/発表者名: 土肥由莉、上野山賀久、束村博子、井上直子
  • 学会等名: 第113回日本繁殖生物学会
• [学会発表] Kiss1発現を制御するエストロジェン受容体αコリプレッサーの探索 (2020)
  • 著者名/発表者名: 宮崎紗衣、井上直子、束村博子、上野山賀久
  • 学会等名: 第113回日本繁殖生物学会
• [学会発表] ATP-プリン受容体シグナリングによるLHサージ制御機構 ～ATPはキスペプチンニューロン不死化細胞のCa2+を上昇させる～ (2020)
  • 著者名/発表者名: 土肥由莉、大塚裕記、上野山賀久、束村博子、井上直子
  • 学会等名: 東海畜産学会
• [学会発表] 弓状核Kiss1発現を制御するエストロジェン受容体αコリプレッサーの探索 (2020)
  • 著者名/発表者名: 宮崎紗衣、井上直子、束村博子、上野山賀久
  • 学会等名: 東海畜産学会
• [学会発表] 弓状核特異的Kiss1レスキュー/ノックアウトラットを用いたGnRHパルスジェネレーターの同定 (2020)
  • 著者名/発表者名: 長江麻佑子、上野山賀久、岡本沙季、土田仁美、池上花奈、後藤哲平、三宝誠、平林真澄、小林憲太、井上直子、束村博子
  • 学会等名: 第25回日本生殖内分泌学会
• [図書] 「繁殖生物学改訂版」日本繁殖生物学会編 (2020)
  • 著者名/発表者名: 束村博子
  • 総ページ数: 179-201
  • 出版者: インターズー