新規ゲノム編集技術による疾患モデルの開発研究

2020 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 18H03974
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 真下 知士 東京大学, 医科学研究所, 教授 (80397554)
• 研究分担者: 吉見 一人 東京大学, 医科学研究所, 講師 (50709813)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: ゲノム編集 / 診断薬 / CRISPR-Cas3 / オフターゲット / 受精卵 / 疾患モデル / DNA修復

研究実績の概要

CRISPR-Cas9を利用することで培養細胞やモデル動物において効率的に遺伝子改変ができるようになったが、未だオフターゲット変異などの安全性や特許紛争などの課題がある。本研究では、新規ゲノム編集技術CRISPR-Cas3を用いることで、哺乳動物培養細胞および実験動物受精卵での効率的なゲノム編集法を確立することが目的である。さらに、このゲノム編集技術CRISPR-Cas3によるDNA切断、およびDNA修復メカニズムを解明することで、ゲノム編集の効率化およびオフターゲット変異の評価等を行う。最後に、確立した新規ゲノム編集技術CRISPR-Cas3を利用して、ヒト遺伝性疾患のex vivo治療、in vivo治療モデルを開発する。本研究により、新しいヒト疾患モデル動物の開発、および新たなゲノム編集治療における革新的基盤技術の開発を目指している。
これまでの研究成果は、論文として取りまとめて投稿している。関連する研究内容を査読付き英文論文12編、国内図書7編に取りまとめた。Cas3タンパク質を製造する方法（特願2021-31907）について、特許出願を行った。その他、招待講演として国際2回、国内7回の講演を行った。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

新規ゲノム編集技術CRISPR-Cas3による哺乳動物細胞および受精卵におけるゲノム編集法の確立、およびゲノム編集動物の作製、治療モデルの開発を目的として、以下の研究を実施した。
① CRISPR-Cas3タンパク質によるDNA切断:大腸菌CRISPR-Cas3システムからタンパク質を精製して、試験管内でのDNA切断を確認した。Cas3の特異的な二本鎖DNA切断の際に、非特異的な一本鎖DNA切断が起こることを発見し、CONANと名付けた。この新しい核酸検出技術を用いて、新型コロナなど新興感染症に対する迅速診断薬の開発を行っている。
② ヒト培養細胞におけるゲノム編集:ヒト培養細胞において、CRISPR-Cas3によるゲノム編集を実施した。大腸菌CRISPR-Cas3システムから精製した高品質タンパク質を利用することでヒト細胞において高効率ゲノム編集に成功した。
③ CRISPR-Cas3システムによるゲノム編集メカニズムの解明、オフターゲット評価:Cas3タンパク質による in vitroゲノム編集を実施して、CRISPR-Cas3システムによるゲノム編集メカニズムの一端を解明した。高速原子力顕微鏡AFMによるDNA二本鎖切断の可視化に成功した。
④ CRISPR/Cas3システムによるゲノム編集モデル動物の作成:CRISPR-Cas3システムをマウス受精卵にマイクロインジェクションにより導入して、マウスTyr遺伝子ノックアウトに成功した。
以上のことから、平成30年度、令和1、２年度開始当初の研究計画に一部の変更はあったものの、おおむね順調に進展していると自己評価する。

今後の研究の推進方策

CRISPR-Cas3による哺乳動物細胞および受精卵におけるゲノム編集法の確立、およびゲノム編集動物の作製、治療モデルの開発を目的として、令和3年度は引き続き、以下の研究を実施する。
① CRISPR-Cas3による核酸検出法：令和1年度に発見したCRISPR-Cas3による非特異的一本鎖DNA切断技術を用いて、新型コロナ変異型やインフレエンザなど新興感染症に対する迅速診断薬の開発を継続する。
② ヒト細胞におけるゲノム編集： 大腸菌CRISPR-Cas3システムから精製した高品質タンパク質を利用して、さらなるヒト細胞における高効率ゲノム編集を実施し、オフターゲット解析による安全性の向上を検討する。
③ CRISPR-Cas3システムによるゲノム編集メカニズムの解明：Cas3タンパク質によるゲノム編集、高速原子力顕微鏡AFMによるDNA二本鎖切断の可視化、DNA修復因子の同定等を行うことで、CRISPR-Cas3によるDNA二本鎖切断およびDNA修復メカニズムを解明する。
④ CRISPR/Cas3システムによるゲノム編集モデル動物の作成：CRISPR-Cas3によるヒト疾患モデル動物の開発を実施する。CRISPR-Cas3発現マウスにおけるin vivoゲノム編集治療モデルの開発を検討する。

研究成果

• [雑誌論文] PHF24 is expressed in the inhibitory interneurons in rats (2021)
  • 著者名/発表者名: Numakura Yuki、Uemura Risa、Tanaka Miyuu、Izawa Takeshi、Yamate Jyoji、Kuramoto Takashi、Kaneko Takehito、Mashimo Tomoji、Yamamoto Takashi、Serikawa Tadao、Kuwamura Mitsuru
  • 雑誌名: Experimental Animals 巻: 70 ページ: 137～143
  • DOI: 10.1538/expanim.20-0105
  • 査読あり
• [雑誌論文] Digenic mutations in ALDH2 and ADH5 impair formaldehyde clearance and cause a multisystem disorder, AMeD syndrome (2020)
  • 著者名/発表者名: Oka Yasuyoshi, Hamada Motoharu, Nakazawa Yuka, Mashimo Tomoji, Kojima Seiji, Ogi Tomoo
  • 雑誌名: Science Advances 巻: 6 ページ: 7197～7197
  • DOI: 10.1126/sciadv.abd7197
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Genetic deletion of the 67‐kDa isoform of glutamate decarboxylase alters conditioned fear behavior in rats (2020)
  • 著者名/発表者名: Fujihara Kazuyuki、Sato Takumi、Miyasaka Yoshiki、Mashimo Tomoji、Yanagawa Yuchio
  • 雑誌名: FEBS Open Bio 巻: 11 ページ: 340～353
  • DOI: 10.1002/2211-5463.13065
  • 査読あり
• [雑誌論文] CRISPR/Cas9-engineered Gad1 elimination in rats leads to complex behavioral changes: implications for schizophrenia (2020)
  • 著者名/発表者名: Fujihara Kazuyuki、Yamada Kazuo、Ichitani Yukio、Kakizaki Toshikazu、Jiang Weiru、Miyata Shigeo、Suto Takashi、Kato Daiki、Saito Shigeru、Watanabe Masahiko、Kajita Yuki、Ohshiro Tomokazu、Mushiake Hajime、Miyasaka Yoshiki、Mashimo Tomoji、Yasuda Hiroki、Yanagawa Yuchio
  • 雑誌名: Translational Psychiatry 巻: 10 ページ: 426
  • DOI: 10.1038/s41398-020-01108-6
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Down syndrome cell adhesion molecule like-1 (DSCAML1) links the GABA system and seizure susceptibility (2020)
  • 著者名/発表者名: Hayase Yoneko, Amano Shigeru, Hashizume Koichi, Tominaga Mashimo Tomoji, Serikawa, Tadao, Sekine Akihiro, Nakagawa Eiji, Takeshita Eri, Yoshikawa Takeo, Waga Chikako, Inoue Ken, Goto Yu-ichi, Nabeshima Yoichi, Ihara Nobuo, Yamakawa Kazuhiro, Taya Shinichiro, Hoshino Mikio
  • 雑誌名: Acta Neuropathologica Communications 巻: 8 ページ: 206
  • DOI: 10.1186/s40478-020-01082-6
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Photoactivatable Cre knock-in mice for spatiotemporal control of genetic engineering in vivo (2020)
  • 著者名/発表者名: Yoshimi Kazuto、Yamauchi Yuko、Tanaka Takao、Shimada Toshio、Sato Moritoshi、Mashimo Tomoji
  • 雑誌名: Laboratory Investigation 巻: 101 ページ: 125～135
  • DOI: 10.1038/s41374-020-00482-5
  • 査読あり
• [雑誌論文] Aspects of Gene Therapy Products Using Current Genome-Editing Technology in Japan (2020)
  • 著者名/発表者名: Yamaguchi Teruhide、Uchida Eriko、Okada Takashi、Ozawa Keiya、Onodera Masafumi、Kume Akihiro、Shimada Takashi、Takahashi Satoru、Tani Kenzaburo、Nasu Yasutomo、Mashimo Tomoji、Mizuguchi Hiroyuki、Mitani Kohnosuke、Maki Kazushige
  • 雑誌名: Human Gene Therapy 巻: 31 ページ: 1043～1053
  • DOI: 10.1089/hum.2020.156
  • 査読あり
• [雑誌論文] Pathophysiological significance of Stim1 mutation in sympathetic response to stress and cardiovascular phenotypes in SHRSP/Izm: In vivo evaluation by creation of a novel gene knock-in rat using CRISPR/Cas9 (2020)
  • 著者名/発表者名: Odongoo Batbayar、Ohara Hiroki、Ngarashi Davis、Kaneko Takehito、Kunihiro Yayoi、Mashimo Tomoji、Nabika Toru
  • 雑誌名: Clinical and Experimental Hypertension 巻: 43 ページ: 34～41
  • DOI: 10.1080/10641963.2020.1797085
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Combi-CRISPR: combination of NHEJ and HDR provides efficient and precise plasmid-based knock-ins in mice and rats (2020)
  • 著者名/発表者名: Yoshimi Kazuto、Oka Yuichiro、Miyasaka Yoshiki、Kotani Yuko、Yasumura Misato、Uno Yoshihiro、Hattori Kosuke、Tanigawa Arisa、Sato Makoto、Oya Manami、Nakamura Kazuhiro、Matsushita Natsuki、Kobayashi Kazuto、Mashimo Tomoji
  • 雑誌名: Human Genetics 巻: 140 ページ: 277～287
  • DOI: 10.1007/s00439-020-02198-4
  • 査読あり
• [雑誌論文] Generation of knockout rabbits with X-linked severe combined immunodeficiency (X-SCID) using CRISPR/Cas9 (2020)
  • 著者名/発表者名: Hashikawa Yoshiko、Hayashi Ryuhei、Tajima Masaru、Okubo Toru、Azuma Shohei、Kuwamura Mitsuru、Takai Naofumi、Osada Yasuyuki、Kunihiro Yayoi、Mashimo Tomoji、Nishida Kohji
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 10 ページ: 9957
  • DOI: 10.1038/s41598-020-66780-6
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Assembly and Function of a Bioengineered Human Liver for Transplantation Generated Solely from Induced Pluripotent Stem Cells (2020)
  • 著者名/発表者名: Takeishi Kazuki, Collin de l’Hortet Alexandra, Wang Yang,Mashimo Tomoji, Fox Ira J., Soto-Gutierrez Alejandro
  • 雑誌名: Cell Reports 巻: 31 ページ: 107711～107711
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2020.107711
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] LOX-1 (Lectin-Like Oxidized Low-Density Lipoprotein Receptor-1) Deletion Has Protective Effects on Stroke in the Genetic Background of Stroke-Prone Spontaneously Hypertensive Rat (2020)
  • 著者名/発表者名: Liang Yi-Qiang、Kakino Akemi、Matsuzaka Yasunari、Mashimo Tomoji、Isono Masato、Akamatsu Tomohisa、Shimizu Hana、Tajima Michiko、Kaneko Takehito、Li Lei、Takeuchi Fumihiko、Sawamura Tatsuya、Kato Norihiro
  • 雑誌名: Stroke 巻: 51 ページ: 1835～1843
  • DOI: 10.1161/STROKEAHA.120.029421
  • 査読あり
• [雑誌論文] ゲノム編集医療－技術開発・治療応用戦略を中心に、特集コーディネーター (2020)
  • 著者名/発表者名: 真下 知士、吉見 一人
  • 雑誌名: 遺伝子医学 巻: 第10巻第4号（通巻34号） ページ: 1～176
• [雑誌論文] 新規ゲノム編集ツールCRISPR-Cas3 (2020)
  • 著者名/発表者名: 真下 知士、吉見 一人
  • 雑誌名: Precision Medicine 巻: 3(6) ページ: 512-515
• [雑誌論文] 効率的なゲノム編集ラットの作製方法 (2020)
  • 著者名/発表者名: 服部晃佑、吉見一人、松下夏樹、小林和人、真下知士
  • 雑誌名: マウス・ラットモデル作製・解析プロフェッショナル. あなたの研究をステップアップさせる最新・最適手技. 先端モデル動物支援プラットフォーム（AdAMS） 巻: - ページ: 54～63
• [雑誌論文] ゲノム編集技術CRISPR-Cas3とその遺伝子治療および診断への応用 (2020)
  • 著者名/発表者名: 藤井智明、吉見一人、真下知士
  • 雑誌名: 実験医学（増刊）新規の創薬モダリティ 細胞医療 巻: Vol.38, No.17 ページ: 49-54
• [雑誌論文] 高血圧関連疾患モデル動物作製の現状と展望 (2020)
  • 著者名/発表者名: 山内祐子、真下知士
  • 雑誌名: 日本臨牀増刊号「高血圧学（上）」 巻: 78巻 ページ: 379-384
• [雑誌論文] CRISPR-Cas3を用いた新しいゲノム編集 (2020)
  • 著者名/発表者名: 吉見一人、真下知士
  • 雑誌名: 医学のあゆみ「ゲノム編集の未来」 巻: Vol.273(9) ページ: 751-755
• [雑誌論文] ゲノム編集技術を用いた遺伝子改変ラットの作製 (2020)
  • 著者名/発表者名: 宮坂佳樹、真下知士
  • 雑誌名: 医学のあゆみ「ゲノム編集の未来」 巻: Vol.273(9) ページ: 785-794
• [学会発表] 新規ゲノム編集技術を用いた次世代CAR-T細胞療法の開発 (2020)
  • 著者名/発表者名: 真下知士
  • 学会等名: 先端的バイオ創薬等基盤技術開発事業研究者交流会
  • 招待講演
• [学会発表] ゲノム編集技術開発の現状と今後 (2020)
  • 著者名/発表者名: 真下知士
  • 学会等名: ゲノム問題検討会議
  • 招待講演
• [学会発表] 遺伝子編集が拓く疾患モデル研究のフロンティア (2020)
  • 著者名/発表者名: 真下知士
  • 学会等名: 第56回高血圧関連疾患モデル学会学術総会、理事長企画／未病栄養シンポジウム
  • 招待講演
• [学会発表] CRISPR-Cas3がもたらす新たなゲノム編集基盤技術 (2020)
  • 著者名/発表者名: 真下知士
  • 学会等名: 基盤技術」」千里ライフサイエンスセミナー「ゲノム編集がもたらす革新と更なる展望」
  • 招待講演
• [学会発表] CRISPR-Cas3: a new tool for genome editing and nucleic acid detection (2020)
  • 著者名/発表者名: Tomoji Mashimo
  • 学会等名: The 15th International Symposium of the Institute Network for Biomedical Sciences
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Rapid and accurate detection of novel coronavirus SARS-CoV-2 using CRISPR-Cas3 (2020)
  • 著者名/発表者名: Tomoji Mashimo
  • 学会等名: A Paradigm shift in Infectious Diseases: A Virtual Conference hosted by Merck KGaA
  • 招待講演
• [学会発表] New CRISPR Technology for Genome Editing (2020)
  • 著者名/発表者名: Tomoji Mashimo
  • 学会等名: 第84回日本循環器学会学術集会Genome editing: CRISPR, Stem cells, and Beyond
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] CRISPR-Cas3 による新しいゲノム編集 (2020)
  • 著者名/発表者名: 真下知士
  • 学会等名: 第72回日本細胞生物学会大会S10次世代型ゲノム編集技術の開発とその応用
  • 招待講演
• [学会発表] 国産新規ゲノム編集技術 CRISPR-Cas3 (2020)
  • 著者名/発表者名: 真下知士
  • 学会等名: 細胞・遺伝子治療―遺伝子解析のその先へー
  • 招待講演
• [備考] 東京大学医科学研究所実験動物研究施設先進動物ゲノム研究分野
  • URL: https://www.ims.u-tokyo.ac.jp/animal-genetics/index.html
• [備考] 東京大学医科学研究所システム疾患モデル研究センター先進モデル動物作製コア
  • URL: https://www.ims.u-tokyo.ac.jp/cemsb/public_html/index.html
• [産業財産権] Cas3タンパク質を製造する方法 (2021)
  • 発明者名: 真下知士、吉見一人、竹下浩平、山本雅貴、渋村里美
  • 権利者名: 東京大学、理化学研究所、C4U株式会社
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 特願2021-31907