| 研究課題/領域番号 |
18H03985
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| 研究機関 | 東京工業大学 |
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研究代表者 |
岩崎 博史 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 教授 (60232659)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 相同組換え / RecA ファミリーリコンビナーゼ / ATPase / Rad51 / Dmc1 / Swi5-Sfr1 複合体 / Hop2-Mnd1 複合体 / DNA鎖交換反応 |
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| 研究実績の概要 |
相同組換えの中心反応は、ATPをコファクターとするRecA ファミリーリコンビナーゼ（ATP依存的組換え酵素）によるDNA鎖交換反応である。このファミリーには、バクテリアRecA、真核生物ではRad51、Dmc1などが属する。RecAファミリータンパク質は、まず、単鎖(ssDNA)と数珠状に結合したプレシナプティックフィラメントを形成し、ドナー二重鎖DNA(dsDNA)に対する相同性検索とDNA鎖の交換を行う。我々は、最近、FRETを用いたDNA鎖交換反応のリアルタイムアッセイ系構築に成功し、分裂酵母 Rad51(spRad51)リコンビナーゼによるDNA鎖交換反応は２つの異なる反応中間体を経て３ステップで進行することを明らかにした。本申請研究では、この研究をさらに発展させ、様々な代表的ATP依存的組換え酵素について普遍性と特異性の検証、相同性認識におけるストリンジェンシー制御機構と補助因子による活性化機構を明らかにすることを目的としている。当該年度は、次の成果を得た。
分裂酵母Rad1ミュータントの解析から、それぞれのDNA結合部位の役割を明らかにした。また、Rad51結合部位を欠損したSfr1の解析から、Rad55-Rad57複合体がSwi5-Sfr1複合体と相互作用して働くことを明らかにした。分裂酵母Dmc1に加えて、その補助因子Hop2-Mnd1複合体とSwi5-Sfr1複合体からなる、試験管内再構成系を確立し生化学的解析を行った。その結果。この二つの補助因子が段階的に互いを補うようにDmc1のDNA鎖交換反応を促進することを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
主に次の3つのプロジェクトを遂行している。
(1) Rad51 によるDNA鎖交換反応の分子機構解析：分裂酵母Rad51の第1DNA結合部位内の2本のDNA結合ループ（L1とL2）及び、第2DNA結合部位内の2カ所のDNA結合部位アミノ酸を、それぞれアラニンに置換した変異体を解析した。その結果、Arg-257（L1ループ）はドナー二重鎖の捕捉に、Val-295（L2ループ）は中間体遷移，第2DNA結合部位はssDNA及びdsDNAの呼び込みに重要な働きをしていることを明らかにした。
(2) 分裂酵母Swi5-Sfr1とRad51の相互作用の解析：NMR及び、細胞内クロスリンクの実験から、Sfr1のN末半分にRad51との相互作用に関与する部位が2カ所存在することを明らかにした。この2カ所の相互作用アミノ酸7個をすべてアラニンに置換した変異体Sfr1-7Aを作成した。Rad51による試験管内鎖交換反応に対する影響を調べたところ、Swi5-Sfr1-7A複合体は、活性化能をほとんど示さなかった。興味深いことに、sfr1欠失変異株は組換えDNA修復能に欠損を示したが、sfr1-7A変異株においては、それがほとんど観察されなかった。ところが、rad57欠損変異株のバックグラウンドでは、sfr1-7A 変異株もsfr1欠損株と同等の欠損を示した。
(3) 分裂酵母Dmc1の反応機構解析:減数分裂特異的リコンビナーゼDmc1、補助因子Swi5-Sfr1とHop2-Mnd1をすべて高純度に精製し、試験管内でDmc1依存的鎖交換反応系を構築して反応機構を解析した。その結果、2種類の補助因子は、全く異なる機構でDmc1を活性化しており、この二つの補助因子が段階的に互いを補うようにDmc1のDNA鎖交換反応を促進することを明らかにした。
これらの成果は、当初の計画以上に伸展していると評価される。
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| 今後の研究の推進方策 |
次の3つのプロジェクトを推進する。
1）Rad51 によるDNA鎖交換反応の分子機構解析：L2ループは、Rad51タンパク質とRecAで高度に保存されているが、Dmc1のL2ループとはその相同性が低い。この違いは、DNA鎖交換可能な配列の相同性度（ストリンジェンシー）に関連すると予想される。すなわち、RecAやRad51はストリンジェンシーが高く、一方でDmc1はストリンジェンシーが低く、この特徴はL2ループの配列の違いによる可能性がある。この仮説について、L2ループをDmc1型とRad51型にスワップすることで検証する。
2）分裂酵母Swi5-Sfr1とRad51の相互作用の解析：これまでの解析から、Swi5-Sfr1がRad55-Rad57と高次複合体を形成して、Rad51のDNA鎖交換反応を補助することを強く示唆する結果を得ている。また、Shu 複合体もRad55-Rad57複合体と相互作用することが予想される。そこで、これらのタンパク質を精製して試験管内で再構成系を構築して解析する。
3）普遍性と特異性： 分裂酵母以外の代表的ATP依存的組換え酵素 [大腸菌RecA、ヒトRad51 (hRad51)、ヒトDmc1 (hDmc1)] について、FRETを利用したリアルタイムアッセイを駆使して、反応機構の普遍性を検証する。特に、ATP結合とATP加水分解の役割に注目する。最近、担子菌類に属するNaganishia 酵母において、BRCA2ホモログが存在することを明らかにしている。ヒトBRCA2は家族性乳がんの原因遺伝子であり、ヒトRAD51の促進因子としてしられている。Naganishia 酵母をモデル系として、BRCA2のRad51に対する促進効果を、我々が開発したリアルタイムアッセイ系を用いて詳細に解析する。
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