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2019 年度 実績報告書

オートファゴソーム形成場のin vitro再構成と作動機構の解明

研究課題

研究課題/領域番号 18H03989
研究機関公益財団法人微生物化学研究会

研究代表者

野田 展生  公益財団法人微生物化学研究会, 微生物化学研究所, 部長 (40396297)

研究期間 (年度) 2018-04-01 – 2021-03-31
キーワードオートファジー / 液-液相分離 / 液滴 / 再構成
研究実績の概要

オートファジーの担い手であるオートファゴソームはAtg蛋白質群が集積したオートファゴソーム形成場(PAS)から作られるが、PASの実体と機能はこれまで不明であった。我々のグループはPASの核を作るAtg1複合体がin vitroにおいて液-液相分離を介して液滴を形成することを見出し、PASは膜のないオルガネラの一種であるという核心を得た。本研究では、in vitroで形成させた液滴状Atg1複合体の形状および性質を解析し、細胞におけるPASとの類似性を検証する。続いてPASの形成を制御しているリン酸化や、Atg1複合体の後にPASに集積する下流Atg因子群の添加を行い、液滴への影響を解析する。以上得られた“再構成PAS”について、その動的微細構造を明らかにする。最後に得られた知見を酵母を用いて検証することで、PASの実体を理解し、そのオートファジーにおける作動機構を明らかにする。
本年度は酵母におけるPASの性質について徹底的な解析を行った。まず定量的なFRAP解析により、PASと細胞質の間でAtg13が頻繁に入れ替わっていること、PASの内部でのAtg13の運動性が高いこと、さらにFCS解析により細胞質とPASにおけるAtg13の拡散係数に大差がないことを明らかにした。またAtg13の発現レベルを調整することでPASの形成過程の観察に成功し、その際はPAS前駆体同士が融合して球形となること、オストヴァルト熟成が見られることを示した。さらにin vitroにおけるAtg1複合体液滴の解析を進め、Atg1複合体の相分離がTORC1によるAtg13のリン酸化で阻害されること、一方ホスファターゼPtc2によるAtg13の脱リン酸化で相分離が促進されることを示し、PASの実体はAtg1複合体が相分離した液滴であることを明らかにした。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

オートファジー分野長年の謎であったPASの実体が、Atg因子が液-液相分離することで形成された液滴であることを証明することに成功した。さらに初期PASの形成を試験管内で再構成することにも成功した。そして一連の成果がNature誌に掲載されるなど、当初の計画以上に進展している。

今後の研究の推進方策

Atg1複合体から形成された初期PASの再構成に成功したため、今後はそこに下流Atg因子群を導入し、成熟型のPASの再構成を進める。そして成熟型PASにおいて脂質膜の変形や伸長など、オートファゴソーム形成に重要な膜動態が再現できるかどうかの解析を進めるとともに、得られた知見を出芽酵母を用いて検証する。

  • 研究成果

    (11件)

すべて 2020 2019 その他

すべて 国際共同研究 (1件) 雑誌論文 (5件) (うち国際共著 1件、 査読あり 3件) 学会発表 (5件) (うち国際学会 1件、 招待講演 5件)

  • [国際共同研究] Max Planck Institute(ドイツ)

    • 国名
      ドイツ
    • 外国機関名
      Max Planck Institute
  • [雑誌論文] Phase separation organizes the site of autophagosome formation2020

    • 著者名/発表者名
      Fujioka Yuko、Alam Jahangir Md.、Noshiro Daisuke、Mouri Kazunari、Ando Toshio、Okada Yasushi、May Alexander I.、Knorr Roland L.、Suzuki Kuninori、Ohsumi Yoshinori、Noda Nobuo N.
    • 雑誌名

      Nature

      巻: 578 ページ: 301~305

    • DOI

      10.1038/s41586-020-1977-6

    • 査読あり / 国際共著
  • [雑誌論文] Liquidity Is a Critical Determinant for Selective Autophagy of Protein Condensates2020

    • 著者名/発表者名
      Yamasaki Akinori、Alam Jahangir Md.、Noshiro Daisuke、Hirata Eri、Fujioka Yuko、Suzuki Kuninori、Ohsumi Yoshinori、Noda Nobuo N.
    • 雑誌名

      Molecular Cell

      巻: 77 ページ: 1163~1175.e9

    • DOI

      10.1016/j.molcel.2019.12.026

    • 査読あり
  • [雑誌論文] 柔らかい構造の可視化-LLPSと膜動態を例に2020

    • 著者名/発表者名
      能代大輔、野田展生
    • 雑誌名

      実験医学

      巻: 38 ページ: 84-89

  • [雑誌論文] 選択的オートファジーの構造生物学的基盤2020

    • 著者名/発表者名
      野田展生
    • 雑誌名

      医学のあゆみ

      巻: 272 ページ: 769-775

  • [雑誌論文] Human ATG2B possesses a lipid transfer activity which is accelerated by negatively charged lipids and WIPI42019

    • 著者名/発表者名
      Osawa Takuo、Ishii Yuki、Noda Nobuo N.
    • 雑誌名

      Genes to Cells

      巻: 25 ページ: 65~70

    • DOI

      10.1111/gtc.12733

    • 査読あり
  • [学会発表] 相分離したタンパク質の選択的オートファジーの試験管内再構成2019

    • 著者名/発表者名
      野田展生
    • 学会等名
      第19回蛋白質科学会年会・第71回日本細胞生物学会大会 合同年次大会
    • 招待講演
  • [学会発表] 液-液相分離とオートファジー2019

    • 著者名/発表者名
      野田展生
    • 学会等名
      第3回LLPS研究会/大阪大学蛋白質研究所セミナー
    • 招待講演
  • [学会発表] 液-液相分離によるオートファジーの始動制御2019

    • 著者名/発表者名
      野田展生
    • 学会等名
      第92回 日本生化学会大会
    • 招待講演
  • [学会発表] Mechanisms of autophagosomal membrane expansion and shaping2019

    • 著者名/発表者名
      Nobuo N. Noda
    • 学会等名
      9th International Symposium on Autophagy
    • 国際学会 / 招待講演
  • [学会発表] オートファジー関連液滴と脂質膜の相互作用基盤2019

    • 著者名/発表者名
      野田展生
    • 学会等名
      第42回 日本分子生物学会年会
    • 招待講演

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公開日: 2021-01-27  

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