| 研究課題/領域番号 |
18H03993
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| 研究機関 | 公益財団法人東京都医学総合研究所 |
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研究代表者 |
佐伯 泰 公益財団法人東京都医学総合研究所, 生体分子先端研究分野, 副参事研究員 (80462779)
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| 研究分担者 |
新井 大祐 早稲田大学, 理工学術院, 講師(任期付) (20624951)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | プロテアソーム / ユビキチン / タンパク質分解 / 質量分析 / 細胞分化 |
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| 研究実績の概要 |
これまでプロテアソームによるタンパク質分解はユビキチン化反応が律速であり、ユビキチン化されれば一義的にプロテアソームで分解されると考えられてきた。しかし近年、ユビキチンデコーダー（情報解読）分子群による基質選別機構やアクセサリー分子群によるプロテアソーム活性の巧妙な制御機構が存在することが明らかとなり、プロテアソーム研究は新時代を迎えている。本研究では、「プロテアソームを中心としたタンパク質分解の分子ネットワークマップ」を作出し、さらに「種々のストレスや細胞分化に伴うプロテアソーム分解ネットワークの変動」を解析することでプロテアソームによるタンパク質分解の統合的理解に挑戦する。
本年度は以下の成果が得られた。
１．プロテアソームを中心とした分子ネットワークマップの作出：これまで約30種類のプロテアソーム結合分子を同定しているが、本年度は２価性クロスリンカーDSSOを用いたクロスリンクIP/MS解析に着手し、プロテアソームと各結合分子の直接の相互作用部位を決定することに成功した。
２．種々のストレスに伴うプロテアソーム分解ネットワークの変動：高浸透圧ストレス刺激に応答してプロテアソームが核内で液－液相分離しタンパク質分解のための液滴を形成することをNature誌に発表した。また、ATP枯渇時に形成するプロテアソーム液滴についても形成機構の一部を解明した。
３．ES細胞特異的プロテアソーム結合分子の解析：内在性のプロテアソームサブユニット遺伝子にEGFP-3xFLAGタグ配列をノックインしたマウスES細胞をin vitroで分化させ、IP/MS解析により両者のプロテアソーム結合分子を網羅的に比較したところ、分化後に減少する分子（UCHL5など）、増加する分子（KIAA0368など）が同定され、分化に伴うプロテアソームの変化が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
プロテアソームを中心とした分解ネットワークマップが完成しつつあり、マウスES細胞の分化に伴う結合分子の変動解析にも成功している。高浸透圧ストレス刺激に応答して形成するプロテアソーム液滴についてNature誌に発表したが、プロテアソームの基質運搬分子RAD23Bやユビキチン選択的シャペロンp97、ユビキチンリガーゼE6-APが協調して核内のタンパク質品質管理を担うことを見出しており、プロテアソーム結合分子群の機能連携と階層性が存在することが明らかとなった。また、p97のユビキチン結合コファクターであるNPL4のK48連結ユビキチン鎖認識機構についてもNat Commun誌に発表した。このように本研究は全体的に順調に進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続き以下の解析を実施する。
１．プロテアソームを中心とした分子ネットワークマップの作出：DSSO/MS3法による直接相互作用部位決定法を拡大し、プロテアソームの分解サイクルにおける各結合分子の機能解析を実施する。
２．種々のストレスに伴うプロテアソーム分解ネットワークの変動：ATP枯渇時に形成するプロテアソーム貯蔵顆粒について論文化を目指す。また、酸化ストレス、分子シャペロン阻害剤処理などプロテオスタシス破綻時の分解ネットワークの変動解析に引き続き実施する。
３．ES細胞特異的プロテアソーム結合分子の解析：引き続き、分化前後で変動する分子群についてドキシサイクリン誘導型ノックダウン、あるいは過剰発現が可能な組換えES細胞を作出し、分化前後で発現量を操作することにより、ES細胞の増殖や分化能に及ぼす影響を解析する。
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