| 研究課題/領域番号 |
18H04016
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
八木 健 大阪大学, 大学院生命機能研究科, 教授 (10241241)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | クラスター型プロトカドヘリン / セルアセンブリ / シングルセル / 細胞系譜 / 短期記憶 / 神経細胞 / 遺伝子組み換えマウス |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、cPcdh遺伝子群の個々の神経細胞でのランダム発現と神経回路形成のメカニズムを捉え、操作することにより、セルアセンブリ形成のメカニズムを明らかにすることである。本年度は、以下の項目で研究成果を上げることができた。
１）cPcdh遺伝子発現を可視化したノックインマウスの作製に成功し、アイソフォーム特異的なランダム発現を確認した。その結果、β3-Tomatoノックインマウスにおいてβ3-Tomatoのランダム発現が比較的安定であることを明らかにすることができた。さらに、β19-Tomato及びβ3-GFPノックインマウスの作製に成功し、対立遺伝子において独立したランダム発現が明らかとなった。
２）キメラマウスの大脳皮質において、同一神経細胞系譜となる神経細胞をホールセルパッチクランプ法により細胞質を吸引してRamDA-seq法を用いてRNAシーケンスを行い、シングルセルレベルでのcPcdh遺伝子発現パターンとクローン性との関係について解析を行った
３）Pcdhαの多様性減少マウスでは、短期記憶の異常が認められている。このマウスを用いて新規環境下における神経活動をc-fos発現を用いて解析した。
４）FRETによりcPcdhアイソフォーム接着活性を可視化するFRET-cPcdhプローブの開発に成功し、このFRET-cPcdhプローブがマウス生体内で機能的であることを明らかにした。
５）58種類のcPcdhアイソフォームの内、マウス生存にはこれまでに知られているcPcdhgC3, gC4, gC5だけでなく、他の53種類のcPcdhアイソフォームもマウス生存に必須であることを明らかにし論文として発表した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
１）cPcdh遺伝子発現を可視化したノックインマウス系統の作製に成功している。β3-Tomatoノックインマウスにおいてβ3-Tomatoのランダム発現が比較的安定していることを明らかにすることができた。さらに、β19-Tomato及びβ3-GFPノックインマウスの作製に成功し、対立遺伝子において独立したランダム発現が明らかとなった。
２）iPS細胞キメラマウスを用いて同一細胞系譜におけるcPcdh遺伝子発現の関係を、単一細胞遺伝子発現解析RamDA-seq法を用いて解析できた。その結果、細胞系譜依存的に発現パターンが一致することを明らかにした。
３）短期記憶の異常が認められているPcdhαの多様性減少マウスの新規環境下における神経活動をc-fos発現パターンにより解析することができた。
４）cPcdhホモフィリック結合をFRETを用いて可視化するFRET-cPcdhプローブの開発に成功した。さらに、トランスジェニックマウス作製により、このFRET-cPcdhプローブがマウス生体内で機能的であることを明らかにすることができた。
５）58種類のcPcdhアイソフォームの内、cPcdhgC3, gC4, gC5だけでなく、他の53種類のcPcdhアイソフォームもマウス生存に必須であることを明らかにし論文として発表することができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、これまでの成果を論文として発表する。
１）cPcdh遺伝子発現を可視化したノックインマウス系統を用いた解析結果を論文としてまとめ発表する。
２）iPS細胞キメラマウスを用いて、RamDA-seq法を用いて解析したシングルセル遺伝子発現解析における同一細胞系譜内でのcPcdh遺伝子発現パターン類似性の結果を論文としてまとめ発表する。。
３）cPcdhホモフィリック結合をFRETを用いて可視化するFRET-cPcdhプローブ開発の研究成果を、論文としてまとめ発表する。
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