研究課題
大腸がん悪性化に関与するドライバー遺伝子がゲノム研究により明らかにされた。一方で、がん組織で認められる遺伝的多様性が悪性化促進に関与する可能性が指摘されているがそのメカニズムは依然として不明である。本研究では、５種類のドライバー遺伝子、Apc、Kras、Tgfbr2、Trp53、Fbxw７（以下、A、K、T、P、F）に異なる組み合わせで変異を導入したマウスモデルの腸管腫瘍由来オルガノイド、およびヒト大腸がん患者由来オルガノイドを用いて、遺伝子変異と微小環境に依存した悪性化機構、そしてがん組織を構成する多様性の役割について解明する。平成30年度は以下の研究結果を得た。（１）各遺伝子型オルガノイド細胞の悪性度検証：最初に単一の遺伝子型細胞による個体レベルでの悪性化形質を検証した。A、AKは粘膜内にとどまる腺腫を発生し、AP、ATは粘膜下浸潤する腺がんを発生することを確認した。AKP、AKTは粘膜下で腺管構造の消失と棘突起構造を呈した。また、AKTP、AKTPFの高い転移能を確認した。（２）腺管構造の変化を伴う遺伝的背景：AKPやAKTオルガノイドが間葉細胞様に組織構造を変化させる現象は、浸潤転移に重要と考えられる。これまでの研究からTGF-betaが上皮間葉転換（EMT）を誘導することが知られているため、TGF-betaと細胞内シグナルを共有するactivinで各遺伝型オルガノイドを刺激した。その結果、顕著な棘突起構造の形成誘導を認める遺伝子型のグループが認められ、細胞外シグナルと遺伝子変異の組み合わせが、浸潤性に関与すると考えられた。（３）ヒト大腸がん組織50検体からオルガノイド培養株を樹立し、その中からTGF-beta刺激により上記と同様の棘突起構造変化を認める２系統を選択した。今後、（２）で推進される研究結果を、これらのヒト大腸がんオルガノイドで検証する。
1: 当初の計画以上に進展している
大腸がん促進における遺伝的多様性を解析するために、均一な遺伝子変異の組み合わせによる悪性度の検証を実施した結果、特定の遺伝子型で、腫瘍細胞が粘膜下浸潤した時に腺管構造を消失させて棘突起構造を呈することを確認した。このような組織構造変化はヒトの大腸がん組織では病理学的にも知られているが、遺伝子変異との相関については明らかにされておらず、新規性の高い知見である。また、粘膜下浸潤領域では強い線維化が見られるため、線維化誘導に関与するTGF-betaファミリーのシグナルに着目してオルガノイド刺激を実施した結果、特定の遺伝子変異グループで同様の棘突起構造変化を示すことを明らかにすることが出来た。以上の研究成果は、特定の遺伝子変異の組み合わせが導入された腫瘍細胞と線維化を主とする細胞外環境との相互作用が、腫瘍組織の浸潤性獲得に関与する可能性を示す知見であり、今後の検証が重要である。本研究目的である、多様性による悪性化促進機構を理解する目的の達成のためにも、それぞれの遺伝子型と微小環境の相互作用による悪性化形質の獲得機構の理解は重要となる。さらに、ヒト大腸がんオルガノイドも計画通りに樹立され、その中から、TGF-beta刺激によりマウスオルガノイドと同様の構造変化を示すオルガノイドを得ることに成功しており、ヒト大腸がんを用いた検証用の研究ツールの開発も行った。以上の研究成果から、本課題研究は当初の計画以上に進展していると判断する。
これまでの研究により、それぞれの遺伝子型オルガノイドに特異的な発現誘導遺伝子群が特定し、データベース化されている。一方で、平成30年度の結果を基盤に粘膜下浸潤能や、棘突起形成により浸潤転移能を獲得など、遺伝子変異型と悪性化形質の相関が明らかになって来た。そこで、特徴的な組織構造変化や転移再発などの悪性化形質を示すオルガノイドに共通して発現誘導される遺伝子群をデータベースから抽出し、機能スクリーニングにより悪性化誘導シグナル経路を特定する。この研究項目では、shRNAやCRISPR/Cas9を用いて特定遺伝子の発現を抑制したオルガノイドを作製し、in vitroおよび移植による個体レベルにおける形質変化を観察して、遺伝子の特定を目指す。一方で、平成30年度の解析で新たに発見したactivinによる腫瘍組織の構造変化の分子機構の解明は、本課題の研究推進に重要に関わることが予想される。そのため、オルガノイド培養実験を中心に、腫瘍組織周囲の線維化構造およびそれに関与するTGF-betaやactivinなどの刺激に依存した、腫瘍組織構造変化と浸潤性獲得機構について研究を展開する。以上の研究結果は、ヒト大腸がんから樹立したオルガノイドを用いた解析によって検証し、ヒト大腸がんの悪性化進展機構を、がん細胞と間質細胞の多様な細胞集団が形成するネットワークの相互作用による悪性化機構を、遺伝子変異と細胞集団の多様性の観点から明らかにする。
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