ダウン症候群に合併する急性巨核芽球性白血病の多段階発症の分子機構

2018 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 18H04039
• 研究機関: 弘前大学
• 研究代表者: 伊藤 悦朗 弘前大学, 医学研究科, 教授 (20168339)
• 研究分担者: 土岐 力 弘前大学, 医学研究科, 講師 (50195731) ; 照井 君典 弘前大学, 医学研究科, 准教授 (00333740) ; 工藤 耕 弘前大学, 医学部附属病院, 助教 (20455728) ; 金崎 里香 弘前大学, 医学研究科, 助教 (60722882)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: ダウン症候群 / 急性巨核芽球性白血病 / GATA1 / 付加的遺伝子異常

研究実績の概要

ダウン症の新生児の約10%に一過性骨髄異常増殖症（TAM）と呼ばれる前白血病が発症し、その約20%は急性巨核芽球性白血病 (DS-AMKL)に進展する。本研究の目的は、申請者らが発見したDS-AMKLの新規遺伝子変異の機能解析を行い、白血病の多段階発症の分子機構を解明し、新規治療法の開発のために様々な遺伝子変異によって共通に障害される経路を明らかにすることである。平成３０年度は、エクソーム解析で見出したDS-AMKLの新規原因遺伝子の機能解析を進めた。
1. X遺伝子の機能解析：最も多いX変異はエクソン3から6が重複を起し、生じるmRNAはinframeであるためDNA結合ドメインが２つ存在する変異タンパクをコードしている。その他にエクソン3から7などの重複も検出された。これらのX-PTD発現ベクターを作製し、CBFβと共に発現させ、以前我々が報告した方法で転写因子としての機能を解析したところ、転写活性が野生型に比べ有意に低下していた。 CRISPR/Cas9システムを用いて、X-PTDノックインマウスを作製した。
2. Y遺伝子の機能解析：Y遺伝子の機能喪失変異が認められたDS-AMKL細胞株にレトロウイルスベクターを用いて野生型Yを遺伝子導入し、細胞増殖におよぼす影響について解析した。その結果、野生型Yを発現させると細胞増殖を抑制することが明らかになった。
3. Z遺伝子の機能解析：Z遺伝子の機能喪失変異が認められたDS-AMKL細胞株に、レトロウイルスベクターを用いて野生型Zを遺伝子導入し、細胞増殖におよぼす影響について解析した。その結果、野生型Yを発現させると細胞増殖を抑制することが明らかになった。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

本年度の目的は、画期的な新規治療法を開発するためにDS-AMKL特異的遺伝子変異の機能解析を行い、白血病の多段階発症の分子機構を解明することである。本年度は、以下の研究成果が得られ、概ね順調に研究が進展している。
1. X遺伝子の機能解析：我々が見出したX-PTD変異の機能解析を進めた。その結果、X-PTDの転写活性は有意に野生型より低下しており、部分的な機能欠失変異であることが推定された。In vivoで、X-PTD変異の機能解析を行なうため、ノックインマウスを作成した。X-PTDヘテロノックインマウスは、メンデルの遺伝形式に従って予想通りに生まれてきた。表現型は正常で、末梢血検査でも異常は認められなかった。このため、X-PTDヘテロノックインマウス同士を掛け合わせ、ホモノックインマウスの作成を進めている。
2. Y遺伝子の機能解析：Y遺伝子の機能喪失変異が認められたDS-AMKL細胞株にレトロウイルスベクターを用いて野生型Yを遺伝子導入し、細胞増殖におよぼす影響について解析した。その結果、野生型Yを発現させると細胞増殖を抑制することが明らかになった。一方。変異Y遺伝子（p.E321fs）を発現させると、細胞増殖は軽度に抑制されたが、その影響は野生型Yより軽度であった。この結果より、Y遺伝子はがん抑制遺伝子として機能していることが明らかになった。
3. Z遺伝子の機能解析： Z遺伝子の機能喪失変異が認められたDS-AMKL細胞株に、レトロウイルスベクターを用いて野生型Zを遺伝子導入し、細胞増殖におよぼす影響について解析した。その結果、野生型Yを発現させると細胞増殖を抑制することが明らかになった。一方、変異Z遺伝子（p.C412R）では細胞増殖の抑制は認められなかった。この結果より、Z遺伝子もがん抑制遺伝子として機能していることが明らかになった。

今後の研究の推進方策

今後は、昨年度の研究成果をもとに、申請者らが発見したDS-AMKLの新規遺伝子変異の機能解析を継続し、白血病の多段階発症の分子機構を解明し、様々な遺伝子変異によって共通に障害される経路を明らかにする。
1. X遺伝子の機能解析：我々が見出したX-PTD変異の機能解析を進めた。その結果、X-PTDの転写活性は有意に野生型より低下していた。本年度は、そのメカニズムを明らかにするため、細胞内局在を解析し、ChIP-seqを行なう。In vivoで、X-PTD変異の機能解析を行なうため、ノックイン (KI) マウスを作成した。X-PTDヘテロKIマウスは、表現型は正常で、末梢血検査でも異常は認められなかった。しかし、最近、早期に死亡するマウスが出現し始めた。今後さらに長期経過観察し、白血病の発症の有無について検索する。ホモKIマウスを作成し、表現型を明らかにする。
2. Y遺伝子の機能解析：Y遺伝子の機能喪失変異が認められたDS-AMKL細胞株にレトロウイルスベクターを用いて野生型Y遺伝子導入実験より、Y遺伝子ががん抑制遺伝子として機能していることが明らかになった。そのメカニズムを明らかにするため、細胞回転の解析やRNA-seqなどを行ない、障害される経路を明らかにする。
3. Z遺伝子の機能解析：Z遺伝子の機能喪失変異が認められたDS-AMKL細胞株に、レトロウイルスベクターを用いて野生型Zを遺伝子導入し、野生型Yを発現させると細胞増殖を抑制することが明らかになった。そのメカニズムを明らかにするため、細胞回転の解析やRNA-seqなどを行ない、障害される経路を明らかにする。
4. A遺伝子の機能解析： A遺伝子の機能喪失変異が認められたDS-AMKL細胞株にレトロウイルスベクターを用いて野生型Aを遺伝子導入し、細胞増殖におよぼす影響について解析する。

研究成果

• [雑誌論文] Pathogenic mutations identified by a multimodality approach in 117 Japanese Fanconi anemia patients. (2019)
  • 著者名/発表者名: Mori M, Hira A, Yoshida K, Muramatsu H, Okuno Y, Shiraishi Y, Anmae M, Yasuda J, Tadaka S, Kinoshita K, Osumi T, Noguchi Y, Adachi S, Kobayashi R, Kawabata H, Imai K, Morio T, Tamura K, Takaori-Kondo A, Yamamoto M, Miyano S, Kojima S, Ito E, Ogawa S, Matsuo K, Yabe H, Yabe M, Takata M.
  • 雑誌名: Haematologica. 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.3324/haematol.2018.207241
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Discontinuation of L-asparaginase and poor response to prednisolone are associated with poor outcome of ETV6-RUNX1-positive pediatric B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. (2019)
  • 著者名/発表者名: Usami I, Imamura T, Takahashi Y, Suenobu SI, Hasegawa D, Hashii Y, Deguchi T, Hori T, Shimada A, Kato K, Ito E, Moriya-Saito A, Kawasaki H, Hori H, Yumura-Yagi K, Hara J, Sato A, Horibe K; Japan Association of Childhood Leukemia Study Group (JACLS).
  • 雑誌名: Int J Hematol 巻: 109 ページ: 477-482
  • DOI: 10.1007/s12185-019-02599-w
  • 査読あり
• [雑誌論文] Zoledronic acid for relapsed Langerhans cell histiocytosis with isolated skull bone lesion. (2019)
  • 著者名/発表者名: Kudo K, Tanaka T, Kobayashi A, Terui K, Ito E.
  • 雑誌名: Pediatr Int. 巻: 61 ページ: 315-317
  • DOI: 10.1111/ped.13774
  • 査読あり
• [雑誌論文] Associations of complementation group, ALDH2 genotype, and clonal abnormalities with hematological outcome in Japanese patients with Fanconi anemia. (2019)
  • 著者名/発表者名: Yabe M, Koike T, Ohtsubo K, Imai E, Morimoto T, Takakura H, Koh K, Yoshida K, Ogawa S, Ito E, Okuno Y, Muramatsu H, Kojima S, Matsuo K, Mori M, Hira A, Takata M, Yabe H.
  • 雑誌名: Ann Hematol. 巻: 98 ページ: 271-280
  • DOI: 10.1007/s00277-018-3517-0
  • 査読あり
• [雑誌論文] Two siblings with familial neuroblastoma with distinct clinical phenotypes harboring an ALK germline mutation. (2018)
  • 著者名/発表者名: Kudo K, Ueno H, Sato T, Kubo K, Kanezaki R, Kobayashi A, Kamio T, Sasaki S, Terui K, Kurose A, Yoshida K, Shiozawa Y, Toki T, Ogawa S, Ito E.
  • 雑誌名: Genes Chromosomes Cancer. 巻: 57 ページ: 665-669
  • DOI: 10.1002/gcc.22676
  • 査読あり
• [雑誌論文] De Novo Mutations Activating Germline TP53 in an Inherited Bone-Marrow-Failure Syndrome. (2018)
  • 著者名/発表者名: Toki T, Yoshida K, Wang R, Kanezaki R, Terui K, Sato T, Kamio T, Ishiguro A Sugita K, Kenmochi N, Takahashi S, Eto K, Ogawa S, Ito E et al.
  • 雑誌名: Am J Hum Genet. 巻: 103 ページ: 440-447
  • DOI: 10.1016/j.ajhg.2018.07.020
  • 査読あり
• [雑誌論文] Diplotype analysis of NUDT15 variants and 6-mercaptopurine sensitivity in pediatric lymphoid neoplasms. (2018)
  • 著者名/発表者名: Tsujimoto S, Osumi T, Uchiyama M, Shirai R, Moriyama T, Nishii R, Yamada Y, Kudo K, Sekiguchi M, Arakawa Y, Yoshida M, Uchiyama T, Terui K, Ito S, Koh K, Takita J, Ito E, Tomizawa D, Manabe A, Kiyokawa N, Yang JJ, Kato M.
  • 雑誌名: Leukemia. 巻: 32 ページ: 2710-2714
  • DOI: 10.1038/s41375-018-0190-1
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Effective response to azacitidine in a child with a second relapse of myeloid leukemia associated with Down syndrome after bone marrow transplantation. (2018)
  • 著者名/発表者名: Uemura S, Mori T, Nagano C, Takafuji S, Nishimura N, Toki T, Terui K, Ito E, Iijima K
  • 雑誌名: Pediatr Blood Cancer. 巻: 0 ページ: e27414
  • DOI: 10.1002/pbc.27414
  • 査読あり
• [学会発表] Integrated genetic and epigenetic analysis elucidated expression and methylation profiles of acute lymphoblastic leukemia in Down syndrome (2018)
  • 著者名/発表者名: Yasuo Kubota, Kumiko Uryu, Tatsuya Ito, Tomoko Kawai, Masafumi Seki, Tomoya Isobe, Tsutomu Toki, Kenichi Yoshida, Keisuke Kataoka, Yuichi Shiraishi, Kenichi Chiba, Hiroko Tanaka, Satoru Miyano, Akira Oka, Yasuhide Hayashi, Seishi Ogawa, Kiminori Terui, Atsushi Sato, Kenichiro Hata, Etsuro Ito, Junko Takita.
  • 学会等名: The 23th Congress of European Hematology Association
  • 国際学会
• [学会発表] Modelling the progression of a preleukemic stage to overt leukemia in children with Down syndrome (2018)
  • 著者名/発表者名: M. Labuhn, K. Perkins, E Papaemmanuil, S Matzk, C Scheer, Kenichi Yoshida, A Schwarzer, J Taub, J Crispino, MJ Weiss, E Ito, Seishi Ogawa, ML Yaspo, PJ Campbell, D Heckl, JH Klusmann, P Vyas.
  • 学会等名: The 60th American Society of Hematology
  • 国際学会
• [学会発表] Clinical and genetic characteristics of patients with Shwachman-Diamond syndrome in Japan (2018)
  • 著者名/発表者名: Kenichiro Watanabe, Hirokazu Kanegane, Takayuki Hamabata, Kagehiro Kozuki, Katsutsugu Umeda, Asahito Hama, Yusuke Okuno, Hideki Muramatsu, Yoshiyuki Takahashi, Daisuke Hasegawa, Atsushi Manabe, Akira Ohara, Masafumi Ito, Seiji Kojima, Etsuro Ito
  • 学会等名: The 60th American Society of Hematology
  • 国際学会
• [学会発表] ダウン症児に発症する巨核芽球性白血病におけるエピゲノム異常 (2018)
  • 著者名/発表者名: 伊藤悦朗
  • 学会等名: 第60回日本小児血液・がん学会学術集会
  • 招待講演
• [学会発表] ダウン症児に発症する巨核芽球性白血病におけるエピゲノム異常 (2018)
  • 著者名/発表者名: 渡辺 亮、才田 聡、中村 正裕、土岐 力、金崎 里香、照井 君典、渡邉 健一郎、伊藤 悦朗
  • 学会等名: 第80回日本血液学会学術集会
  • 招待講演