ダウン症候群に合併する急性巨核芽球性白血病の多段階発症の分子機構

2019 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 18H04039
• 研究機関: 弘前大学
• 研究代表者: 伊藤 悦朗 弘前大学, 医学研究科, 教授 (20168339)
• 研究分担者: 土岐 力 弘前大学, 医学研究科, 講師 (50195731) ; 照井 君典 弘前大学, 医学研究科, 准教授 (00333740) ; 工藤 耕 弘前大学, 医学部附属病院, 助教 (20455728) ; 金崎 里香 弘前大学, 医学研究科, 助教 (60722882)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: ダウン症候群 / 急性巨核芽球性白血病 / GATA1 / 付加的遺伝子異常

研究実績の概要

ダウン症の新生児の約10%に一過性骨髄異常増殖症（TAM）と呼ばれる前白血病が発症し、その約20%は急性巨核芽球性白血病（DS-AMKL）に進展する。本研究の目的は、申請者らが発見したDS-AMKLの新規遺伝子変異の機能解析を行い、白血病の多段階発症の分子機構を解明し、新規治療法の開発のために様々な遺伝子変異によって共通に障害される経路を明らかにすることである。令和元年度は、エクソーム解析で見出したDS-AMKLの新規原因遺伝子の機能解析を進めた。
1. X遺伝子の機能解析：最も多いX-PTD変異はエクソン3から6が重複を起し、DNA結合ドメインが２つ存在する変異タンパクをコードしていた。ChIPシークエンスでは、X-PTDと野生型に有意な結合配列の違いは認められなかった。しかし、細胞内局在を解析したところ、野生型Xが主に核に局在するのに対して、X-PTDは細胞質に主に存在していることが明らかとなった。X-PTDノックイン（KI）ヘテロマウスは高率に白血病（T-ALL）を発症することが明らかになった。
2. Y遺伝子の機能解析：Y遺伝子の機能喪失変異が認められたDS-AMKL細胞株にレトロウイルスベクターを用いて野生型Yを遺伝子導入し、細胞増殖におよぼす影響について解析した。その結果、細胞回転をG0/G1期で止めることで、細胞増殖を抑制することが明らかになった。
3. ZおよびA遺伝子の機能解析：Z遺伝子とA遺伝子の機能喪失変異が認められたDS-AMKL細胞株に、レトロウイルスベクターを用いてそれぞれの遺伝子を発現させ、細胞増殖におよぼす影響について解析した。その結果、細胞回転をG0/G1期で止めることで、細胞増殖を抑制することが明らかになった。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

令和元年度の目的は、画期的な新規治療法を開発するためにDS-AMKL特異的遺伝子変異の機能解析を行い、白血病の多段階発症の分子機構を解明することである。令和元年度は、以下の研究成果が得られ、概ね順調に研究が進展している。
1. X遺伝子の機能解析：X-PTDの転写活性は有意に野生型より低下していた。ChIPシークエンスでは、両者に結合配列の違いは認められなかったが、細胞内局在を解析したところ、野生型Xが主に核に局在するのに対して、X-PTDは細胞質に主に存在していた。X-PTDヘテロKIマウスは、メンデルの遺伝形式に従って予想通りに生まれてきた。しかし、ホモKIマウスの出生数は、期待値より少なかった。ヘテロKIマウスは、白血球と血小板減少が認められた。一方、ホモKIマウスは、貧血も認められた。ヘテロKIマウスは、白血病（T-ALL）が高率にかつ短期間に発症した。
2. Y遺伝子の機能解析：Y遺伝子の機能喪失変異が認められたDS-AMKL細胞株にレトロウイルスベクターを用いて野生型Yを遺伝子導入し、細胞増殖におよぼす影響について解析した。その結果、野生型Yを発現させると、細胞回転をG0/G1期で止めることで、細胞増殖を抑制することが明らかになった。
3. ZおよびA遺伝子の機能解析：ZとA遺伝子の発現が低下しているDS-AMKL細胞株に、レトロウイルスベクターを用いて野生型Zを遺伝子導入し、細胞増殖におよぼす影響について解析した。その結果、野生型Zを発現させると、細胞回転をG0/G1期で止めることで、細胞増殖を抑制することが明らかになった。これらの結果より、Y、ZおよびA遺伝子はがん抑制遺伝子として機能していることが明らかになった。

今後の研究の推進方策

今後は、令和元年度の研究成果をもとに、申請者らが発見したDS-AMKLの新規遺伝子変異の機能解析を継続し、白血病の多段階発症の分子機構を解明し、様々な遺伝子変異によって共通に障害される経路を明らかにする。
1. X遺伝子の機能解析：X-PTD KIヘテロマウスは高率に白血病を発症することが明らかになった。しかし、生じた白血病はAMKLではなく、T-ALLであった。そこで、令和2年度は、X-PTD KIヘテロマウスとGATA1sマウスを掛け合わせ、AMKLが発症するかどうかを検証する。掛け合わせ実験によりAMKLが生じた場合は、白血病細胞を用いて、RNAシークエンスを行い、実際のDS-AMKLの遺伝子発現パターンと比較検討する。また、エクソームシーケンスを行い、セカンドヒットとなる遺伝子変異を検索する。
2. Y遺伝子の機能解析：Y遺伝子の機能喪失変異が認められたDS-AMKL細胞株にレトロウイルスベクターを用いて野生型Y遺伝子導入実験より、Y遺伝子ががん抑制遺伝子として機能していることが明らかになった。そのメカニズムを明らかにするため、RNAシークエンスを行ない、障害されている経路を明らかにする。次に、ChIPシークエンスを行って遺伝子発現パターンの結果と合わせてY転写因子の標的遺伝子を同定する。
3. ZおよびA遺伝子の機能解析：Z遺伝子とA遺伝子の機能喪失変異が認められたDS-AMKL細胞株に各々の野生型遺伝子を発現させた結果、細胞増殖が著明に抑制され、これらの遺伝子もがん抑制遺伝子として機能していることが明らかになった。そのメカニズムを明らかにするため、RNAシークエンスを行ない、障害されている経路を明らかにする。2と３の実験結果より、TAMからDS-AMKL発症に至る共通の経路を明らかにする。

研究成果

• [雑誌論文] Pathogenic mutations identified by a multimodality approach in 117 Japanese Fanconi anemia patients. (2020)
  • 著者名/発表者名: Mori M, Hira A, Yoshida K, Muramatsu H, Okuno Y, Shiraishi Y, Anmae M, Yasuda J, Tadaka S, Kinoshita K, Osumi T, Noguchi Y, Adachi S, Kobayashi R, Kawabata H, Imai K, Morio T, Tamura K, Takaori-Kondo A, Yamamoto M, Miyano S, Kojima S, Ito E, Ogawa S, Matsuo K, Yabe H, Yabe M, Takata M.
  • 雑誌名: Haematologica 巻: 105 ページ: 1166-116
  • DOI: 10.3324/haematol.2019.245720
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] A Rapid Cytologic Double Staining of Epstein-Barr Virus-encoded Small RNA and Cell Surface Markers for Diagnosis of Epstein-Barr Virus-associated Hemophagocytic Lymphohistiocytosis (2019)
  • 著者名/発表者名: Takahashi N, Kudo K, Tanaka M, Kumagai N, Sato T, Kamio T, Sasaki S, Terui K, Kurose A, Yanagisawa R, Nakazawa Y, Ito E.
  • 雑誌名: J Pediatr Hematol Oncol. 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1097/MPH.0000000000001647
  • 査読あり
• [雑誌論文] Highly sensitive detection of GATA1 mutations in patients with myeloid leukemia associated with Down syndrome by combining Sanger and targeted next generation sequencing. (2019)
  • 著者名/発表者名: Terui K, Toki T, Taga T, Iwamoto S, Miyamura T, Hasegawa D, Moritake H, Hama A, Nakashima K, Kanezaki R, Kudo K, Saito AM, Horibe K, Adachi S, Tomizawa D, Ito E.
  • 雑誌名: Genes Chromosomes Cancer. 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1002/gcc.22816.
  • 査読あり
• [雑誌論文] A pediatric case of secondary T-cell acute lymphoblastic leukemia with KMT2A-MAML2 developing after hepatoblastoma treatment (2019)
  • 著者名/発表者名: Takahashi Y, Terui K, Chinen Y, Tandai S, Kudo K, Sasaki S, Tono C, Taki T, Ito E.
  • 雑誌名: Pediatr Blood Cancer 巻: - ページ: e28033
  • DOI: 10.1002/pbc.28033
  • 査読あり
• [雑誌論文] Study of pathophysiology and molecular characterization of congenital anemia in India using targeted next-generation sequencing approach (2019)
  • 著者名/発表者名: Kedar PS, Harigae H, Ito E, Muramatsu H, Kojima S, Okuno Y, Fujiwara T, Dongerdiye R, Warang PP, Madkaikar MR
  • 雑誌名: Int J Hematol 巻: 110 ページ: 618-626
  • DOI: 10.1007/s12185-019-02716-9
  • 査読あり
• [雑誌論文] Integrated genetic and epigenetic analysis revealed heterogeneity of acute lymphoblastic leukemia in Down syndrome (2019)
  • 著者名/発表者名: Kubota Y, Uryu K, Ito T, Seki M, Kawai T, Isobe T, Kumagai T, Toki T, Yoshida K, Suzuki H, Kataoka K, Shiraishi Y, Chiba K, Tanaka H, Ohki K, Kiyokawa N, Kagawa J, Miyano S, Oka A, Hayashi Y, Ogawa S, Terui K, Sato A, Hata K, Ito E, Takita J
  • 雑誌名: Cancer Sci. 巻: 110 ページ: 3358-3367
  • DOI: 10.1111/cas.14160
  • 査読あり
• [雑誌論文] Resistance of t(17;19)-acute lymphoblastic leukemia cell lines to multiagents in induction therapy. (2019)
  • 著者名/発表者名: Watanabe A, Inukai T, Kagami K, Abe M, Takagi M, Fukushima T, Fukushima H, Nanmoku T, Terui K, Ito T, Toki T, Ito E, Fujimura J, Goto H, Endo M, Look T, Kamps M, Minegishi M, Takita J, Inaba T, Takahashi H, Ohara A, Harama D, Shinohara T, Somazu S, Oshiro H, Akahane K, Goi K, Sugita K.
  • 雑誌名: Cancer Med. 巻: 7 ページ: 5274-5288
  • DOI: 10.1002/cam4.2356.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Mechanisms of Progression of Myeloid Preleukemia to Transformed Myeloid Leukemia in Children with Down Syndrome. (2019)
  • 著者名/発表者名: Labuhn M, Perkins K, Matzk S, Ito E, Klusmann JH, et al.
  • 雑誌名: Cancer Cell. 巻: 36 ページ: 123-138
  • DOI: 10.1016/j.ccell.2019.06.007
  • 査読あり
• [雑誌論文] KLF1 mutation E325K induces cell cycle arrest in erythroid cells differentiated from congenital dyserythropoietic anemia patient-specific induced pluripotent stem cells. (2019)
  • 著者名/発表者名: Kohara H, Utsugisawa T, Sakamoto C, Hirose L, Ogawa Y, Ogura H, Sugawara A, Liao J, Aoki T, Iwasaki T, Asai T, Doisaki S, Okuno Y, Muramatsu H, Abe T, Kurita R, Miyamoto S, Sakuma T, Shiba M, Yamamoto T, Ohga S, Yoshida K, Ogawa S, Ito E, Kojima S, Kanno H, Tani K.
  • 雑誌名: Exp Hematol. 巻: 73 ページ: 25-37.e8
  • DOI: 10.1016/j.exphem.2019.03001
  • 査読あり
• [学会発表] Post-induction minimal residual disease measured by flow cytometry and deep sequencing of mutant GATA1 are both significant prognostic factors for children with myeloid leukemia and Down syndrome: a nationwide prospective study of the Japanese Pediatric Leukemia/Lymphoma Study Group. (2019)
  • 著者名/発表者名: Takashi Taga, Shiro Tanaka,, Kiminori Terui, Tsutomu Toki, Etsuro Ito, et al.
  • 学会等名: American Society of Hematology 61th Annual Meetin
  • 国際学会
• [学会発表] BRAFV600E-POSITIVE PRECURSORS AS MOLECULAR MARKERS OF BONE MARROW INVOLVEMENT IN PEDIATRIC LANGERHANS CELL HISTIOCYTOSIS. (2019)
  • 著者名/発表者名: Ko Kudo, Rika Kanezaki, Masaru Imamura, Chihaya Imai, Masahiro Irie, Yoji Sasahara, Kumiko Ando, Harumi Kakuda, Takehiko Doi, Hiroshi Kawaguchi, Kazuko Kudo, Hirokazu Kanegane, Tsutomu Toki, and Etsuro Ito.
  • 学会等名: 35th Annual Meeting of the Histiocyte Society
  • 国際学会