| 研究課題/領域番号 |
18H05283
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
小守 壽文 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 教授 (00252677)
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| 研究分担者 |
川根 徹也 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 客員研究員 (00265208)
姜 晴 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 助教 (00790007)
宮崎 敏博 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 准教授 (10174161)
森石 武史 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 助教 (20380983)
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| 研究期間 (年度) |
2018-06-11 – 2023-03-31
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| キーワード | 発現制御 / 細胞・組織 / 発生・分化 / 歯学 |
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| 研究実績の概要 |
Runx2は間葉系幹細胞より骨芽細胞分化に必須であるとともに、軟骨細胞の後期分化（成熟）に必須である。そして、Runx2は関節軟骨等の永久軟骨の性格を失わせ、永久軟骨細胞を成熟させ軟骨基質を破壊するmatrix metalloproteinase 13 (MMP13)等を誘導する働きがあり、関節軟骨細胞の破壊によって発症する変形性関節症の原因遺伝子の一つである。したがって、Runx2は成人において、骨に対しては正の作用、関節軟骨に対しては負の作用を持つ。Runx2は、２つのプロモーター｛遠位(P1)および近位(P2)｝によって転写調節されている。しかし、P1、P2領域を用いたレポーターマウスでは、骨芽細胞・軟骨細胞での発現を得ることはできなかった。そこで、Runx2遺伝子のエンハンサーを探索した。Runx2のゲノム領域を含むBAC(bacterial artificial chromosome)クローン（200kb）を用いたGFPレポーターマウスを作成、BACクローンを徐々に欠失させていくことにより、骨芽細胞特異的エンハンサー及び軟骨細胞特異的エンハンサーを同定した。しかし、これらの領域を欠失させても表現型は出現せず、骨芽細胞・軟骨細胞での発現は、ともに複数のエンハンサーによって制御されていると考えられた。そこで、H3K27アセチル化抗体、H3K4モノメチル抗体、H3K4ジメチル抗体を用いたChIP シークエンス及びenhancer RNAシークエンスを行い、種間のホモロジーも考慮してRunx2ゲノム上に計１９箇所のエンハンサー候補を同定した。これらの単独あるいは複数を欠失したマウスの作成を行っている。単独の欠失マウスの作製はほぼ終了したが、解析が終了したマウスで、表現型の出現したマウスはまだ出現していない。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
CRISPR/Cas9システムを用いた、エンハンサー候補を欠失させたマウスの作製は順調に進んでいる。ただし、解析が終了した単独のエンハンサー候補の欠失では表現系は出現せず、複数の欠失を持ったマウスの作製及び解析を進めている。軟骨細胞特異的エンハンサーを用いたcDNAライブラリーの作成及びルシフェラーゼベクターの作成は終了し、条件検討も完了し、スクリーニングを開始している。capture Hi-C法によるプロモーターと相互作用するエンハンサーの同定、enChIP法によるプロモーター及びエンハンサーに結合する蛋白質の同定は、条件設定に時間がかかったが、進行している。
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| 今後の研究の推進方策 |
エンハンサー候補を単独あるいは複数欠失させたマウスで、Runx2発現の低下が認められたマウスに関しては、Runx2ヘテロ変異マウスと交配し、エンハンサーヘテロ/Runx2ヘテロ変異マウスを作製し、表現型を解析する。エンハンサー候補を欠失させたマウスの作製とともに、エンハンサー候補をHsp68 minimal promoterあるいはRunx2のP1、P2プロモーターに結合させたGFPレポーターマウスを作製し、凍結切片でGFPの発現を検討し、骨芽細胞、軟骨細胞での発現を調べる。これにより、複数欠失させるエンハンサー候補を決める。
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