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2018 年度 実績報告書

軟骨細胞特異的Runx2エンハンサー制御機構の解明と変形性関節症治療薬の開発

研究課題

研究課題/領域番号 18H05283
研究機関長崎大学

研究代表者

小守 壽文  長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 教授 (00252677)

研究分担者 川根 徹也  長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 客員研究員 (00265208)
姜 晴  長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 助教 (00790007)
宮崎 敏博  長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 准教授 (10174161)
森石 武史  長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 助教 (20380983)
研究期間 (年度) 2018-06-11 – 2023-03-31
キーワード発現制御 / 細胞・組織 / 発生・分化 / 歯学
研究実績の概要

Runx2は間葉系幹細胞より骨芽細胞分化に必須であるとともに、軟骨細胞の後期分化(成熟)に必須である。そして、Runx2は関節軟骨等の永久軟骨の性格を失わせ、永久軟骨細胞を成熟させ軟骨基質を破壊するmatrix metalloproteinase 13 (MMP13)等を誘導する働きがあり、関節軟骨細胞の破壊によって発症する変形性関節症の原因遺伝子の一つである。したがって、Runx2は成人において、骨に対しては正の作用、関節軟骨に対しては負の作用を持つ。Runx2は、2つのプロモーター{遠位(P1)および近位(P2)}によって転写調節されている。しかし、P1、P2領域を用いたレポーターマウスでは、骨芽細胞・軟骨細胞での発現を得ることはできなかった。そこで、Runx2遺伝子のエンハンサーを探索した。Runx2のゲノム領域を含むBAC(bacterial artificial chromosome)クローン(200kb)を用いたGFPレポーターマウスを作成、BACクローンを徐々に欠失させていくことにより、骨芽細胞特異的エンハンサー及び軟骨細胞特異的エンハンサーを同定した。しかし、これらの領域を欠失させても表現型は出現せず、骨芽細胞・軟骨細胞での発現は、ともに複数のエンハンサーによって制御されていると考えられた。そこで、H3K27アセチル化抗体、H3K4モノメチル抗体、H3K4ジメチル抗体を用いたChIP シークエンス及びenhancer RNAシークエンスを行い、種間のホモロジーも考慮してRunx2ゲノム上に計19箇所のエンハンサー候補を同定した。これらの単独あるいは複数を欠失したマウスの作成を行っている。単独の欠失マウスの作製はほぼ終了したが、解析が終了したマウスで、表現型の出現したマウスはまだ出現していない。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

CRISPR/Cas9システムを用いた、エンハンサー候補を欠失させたマウスの作製は順調に進んでいる。ただし、解析が終了した単独のエンハンサー候補の欠失では表現系は出現せず、複数の欠失を持ったマウスの作製及び解析を進めている。軟骨細胞特異的エンハンサーを用いたcDNAライブラリーの作成及びルシフェラーゼベクターの作成は終了し、条件検討も完了し、スクリーニングを開始している。capture Hi-C法によるプロモーターと相互作用するエンハンサーの同定、enChIP法によるプロモーター及びエンハンサーに結合する蛋白質の同定は、条件設定に時間がかかったが、進行している。

今後の研究の推進方策

エンハンサー候補を単独あるいは複数欠失させたマウスで、Runx2発現の低下が認められたマウスに関しては、Runx2ヘテロ変異マウスと交配し、エンハンサーヘテロ/Runx2ヘテロ変異マウスを作製し、表現型を解析する。エンハンサー候補を欠失させたマウスの作製とともに、エンハンサー候補をHsp68 minimal promoterあるいはRunx2のP1、P2プロモーターに結合させたGFPレポーターマウスを作製し、凍結切片でGFPの発現を検討し、骨芽細胞、軟骨細胞での発現を調べる。これにより、複数欠失させるエンハンサー候補を決める。

  • 研究成果

    (12件)

すべて 2019 2018

すべて 雑誌論文 (6件) (うち査読あり 6件、 オープンアクセス 5件) 学会発表 (6件) (うち招待講演 1件)

  • [雑誌論文] Runx2 regulates cranial suture closure by inducing hedgehog, Fgf, Wnt and Pthlh signaling pathway gene expressions in suture mesenchymal cells2019

    • 著者名/発表者名
      Qin Xin、Jiang Qing、Miyazaki Toshihiro、Komori Toshihisa
    • 雑誌名

      Human Molecular Genetics

      巻: 28 ページ: 896~911

    • DOI

      10.1093/hmg/ddy386

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Sphenoid bone hypoplasia is a skeletal phenotype of cleidocranial dysplasia in a mouse model and patients2019

    • 著者名/発表者名
      Mitomo Keisuke、Matsunaga Satoru、Kitamura Kei、Nakamura Takashi、Saito Akiko、Komori Toshihisa、Muramatsu Takashi、Yamaguchi Akira
    • 雑誌名

      Bone

      巻: 120 ページ: 176~186

    • DOI

      10.1016/j.bone.2018.10.028

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Collapsin Response Mediator Protein 1, a Novel Marker Protein for Differentiated Odontoblasts2018

    • 著者名/発表者名
      Miyazaki Toshihiro、T. Baba Tomomi、Mori Masako、Komori Toshihisa
    • 雑誌名

      ACTA HISTOCHEMICA ET CYTOCHEMICA

      巻: 51 ページ: 185~190

    • DOI

      10.1267/ahc.18030

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Runx2 is required for the proliferation of osteoblast progenitors and induces proliferation by regulating Fgfr2 and Fgfr32018

    • 著者名/発表者名
      Kawane Tetsuya、Qin Xin、Jiang Qing、Miyazaki Toshihiro、Komori Hisato、Yoshida Carolina Andrea、Matsuura-Kawata Viviane Keiko dos Santos、Sakane Chiharu、Matsuo Yuki、Nagai Kazuhiro、Maeno Takafumi、Date Yuki、Nishimura Riko、Komori Toshihisa
    • 雑誌名

      Scientific Reports

      巻: 8 ページ: 13551

    • DOI

      10.1038/s41598-018-31853-0

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Runx2, an inducer of osteoblast and chondrocyte differentiation2018

    • 著者名/発表者名
      Komori Toshihisa
    • 雑誌名

      Histochemistry and Cell Biology

      巻: 149 ページ: 313~323

    • DOI

      10.1007/s00418-018-1640-6

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Loss of Stemness, EMT, and Supernumerary Tooth Formation in Cebpb?/?Runx2+/? Murine Incisors2018

    • 著者名/発表者名
      Saito Kazuyuki、Takahashi Katsu、Huang Boyen、Asahara Masakazu、Kiso Honoka、Togo Yumiko、Tsukamoto Hiroko、Mishima Sayaka、Nagata Masaki、Iida Machiko、Tokita Yoshihito、Asai Masato、Shimizu Akira、Komori Toshihisa、Harada Hidemitsu、MacDougall Mary、Sugai Manabu、Bessho Kazuhisa
    • 雑誌名

      Scientific Reports

      巻: 8 ページ: 5169

    • DOI

      10.1038/s41598-018-23515-y

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] Runx2による骨格形成制御機構2019

    • 著者名/発表者名
      小守 壽文
    • 学会等名
      第124回日本日本解剖学会全国学術集会
    • 招待講演
  • [学会発表] Runx2による骨芽細胞分化・増殖の制御機構2018

    • 著者名/発表者名
      小守 壽文
    • 学会等名
      第36回日本骨代謝学会学術集会
  • [学会発表] オステオカルシンはアパタイト結晶のコラーゲン線維に沿った配向に必須であり、長軸方向の骨強度を維持する2018

    • 著者名/発表者名
      森石武史,小笹良輔,中野貴由,宮崎敏博,小守壽文
    • 学会等名
      第36回日本骨代謝学会学術集会
  • [学会発表] Runx2は骨芽細胞分化後の骨基質蛋白質遺伝子発現に必要である2018

    • 著者名/発表者名
      姜晴,秦昕,宮崎敏博,福山亮,小守寿人,森石武史,伊藤公成,小守壽文
    • 学会等名
      第36回日本骨代謝学会学術集会
  • [学会発表] Runx2による頭蓋冠形成制御機構2018

    • 著者名/発表者名
      秦昕,姜晴,宮崎敏博,森石武史,小守寿人,小守壽文
    • 学会等名
      第36回日本骨代謝学会学術集会
  • [学会発表] 骨形成におけるゴルジ体キナーゼFam20Cの役割2018

    • 著者名/発表者名
      廣瀬勝俊,宇佐美悠,佐藤淳,大家香織,小守壽文,豊澤悟
    • 学会等名
      第36回日本骨代謝学会学術集会

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公開日: 2019-12-27   更新日: 2021-12-27  

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