| 研究課題/領域番号 |
18J01790
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| 研究機関 | 岐阜薬科大学 |
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研究代表者 |
石田 慶士 岐阜薬科大学, 薬学研究科, 特別研究員(PD)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-25 – 2021-03-31
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| キーワード | NRF-1 / 毒性評価系 / UBE2D1 |
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| 研究実績の概要 |
これまでに、化学物質曝露による神経細胞の脆弱化が転写因子NRF-1活性低下に起因する可能性を明らかにしている。本研究の目的は、NRF-1の機能が低下した際に引き起こされる生体への神経毒性影響を明らかにし、神経毒性を有する化学物質を見出す効率的な試験系を構築することである。
具体的には、NRF-1活性依存的な発光が得られる改良型in vitro 評価系の構築を目指し、平成３０年度は以下の通り研究を実施した。pGL4.23(プロメガ社)ベクターをベースにしたレポータープラスミドにNRF-1応答配列を組み込み、培養細胞に一過的に発現させることで作製したレポータープラスミドがNRF-1の活性依存的な応答を示すことを確認した。このプラスミドがNRF-1活性依存的なルシフェラーゼ活性を示し、正確に働くことを確認した。また、構築したプラスミドからレンチウイルスベクターを作製し、安定発現細胞の取得を試みたところ、いくつかのクローンの有力候補を得ており、現在最適なクローン選別を行っているところである。
NRF-1機能低下のよる毒性影響の全貌を理解するためには、まだ十分に明らかになっていないNRF-1によって発現制御を受ける遺伝子を同定する必要がある。そこで、NRF-1をノックダウンした際に変動する遺伝子を網羅的に探索したところ、そのひとつとしてユビキチン結合酵素E2D1(UBE2D1)が検出された。さらにNRF-1とプロモーターの結合を評価したところ、NRF-1はUBE2D1の第１エクソン付近に結合することが明らかとなった。以上の結果より、NRF-1の新規下流遺伝子としてUBE2D1が同定された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成30年度はNRF-1応答性レポータープラスミドを構築し、このプラスミドがNRF-1活性依存的なルシフェラーゼ活性を示し、正確に働くことを確認した。また、構築したプラスミドからレンチウイルスベクターを作製し、安定発現細胞の取得を試みたところ、いくつかのクローンの有力候補を得ており、現在最適なクローン選別を行っているところである。
また、NRF-1の新規下流遺伝子の探索を行ったところ、ユビキチン結合酵素E2D1がNRF-1によって直接的な制御を受けることが明らかとなった。この結果から、化学物質によるNRF-1の機能低下がUBE2D1の発現減少を介してタンパク質の分解機構に障害を引き起こす可能性が考えられる。
以上より、平成30年度はおおむね順調に進展したと考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度は引き続きレポーター細胞の選別作業を進め、NRF-1の活性を評価するために最適なクローンの取得を目指す。レポーター細胞の選別作業が終了後、様々な種類の化学物質を様々な濃度で曝露し、NRF-1活性と化学物質の曝露濃度の相関性を明らかにする予定である。
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