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2018 年度 実績報告書

細胞内環境応答性人工核酸による血管内皮細胞マイクロRNA制御と脳梗塞治療薬の開発

研究課題

研究課題/領域番号 18J11742
研究機関東北大学

研究代表者

稲垣 雅仁  東北大学, 理学研究科, 特別研究員(DC2)

研究期間 (年度) 2018-04-25 – 2020-03-31
キーワード刺激応答性人工核酸 / 虚血性疾患選択的核酸医薬 / ペプチドリボ核酸(PRNA) / ホウ酸エステル結合 / 核酸塩基部配向変化 / 触媒的核酸医薬 / キメラ人工核酸 / RNase H活性
研究実績の概要

本年度は、マイクロRNA機能制御による効果的な脳梗塞治療薬開発を目指し、人工核酸誘導体を核酸医薬へと応用する上で重要な課題として指摘されているオフターゲット効果の克服のため、細胞内環境応答性人工核酸による虚血性疾患選択的核酸医薬系ならびにRNase H活性を利用した触媒的核酸医薬系の構築に取り組み、両方法論の有効性の実証に成功した。虚血性疾患選択的核酸医薬系の構築においては、当研究室で報告してきたペプチドリボ核酸(PRNA)の適用を提案し、脳梗塞のペナンブラと呼ばれる虚血領域において選択的に薬効発現可能な第二世代PRNAの開発に成功した。第二世代PRNAでは、リボース骨格とグルタミン酸誘導体から構成されるPRNAに対してリシンリンカーを介してフェニルボロン酸誘導体を導入することにより、虚血細胞と正常細胞間における細胞内pH変化のみによってPRNAの核酸塩基部配向を自在に制御できることを見出した。さらに、第二世代PRNAの薬効発現に重要な核酸塩基部配向変化pH(pKs)はハメット則に従い、フェニルボロン酸フェニル基上への置換基導入によりチューニング可能であり様々な疾患へと適用できる画期的な方法論である。触媒的核酸医薬系の構築においては、より高効率な標的RNA切断を達成する為に、DNA-ペプチド核酸(PNA)/PRNAキメラ分子を設計・合成し、RNase Hによる標的RNA切断後の解離過程促進を目的とした新規方法論の構築に成功した。本キメラ分子を用いることにより、切断後RNA断片の複合体安定性が生体内環境37度以下になるような位置で選択的に標的RNAを切断できれば、切断後速やかに解離し、核酸医薬のターンオーバー数が飛躍的に向上することを見出した。また、キメラ分子を適切に設計することにより、標的RNAの部位特異的一箇所切断が可能となりゲノム編集ツールなど幅広い応用が期待される。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

脳梗塞などの虚血性疾患選択的なマイクロRNA阻害を達成する為に、細胞内環境応答性ペプチドリボ核酸(PRNA)による虚血性疾患選択的核酸医薬系ならびにRNase H活性を利用した触媒的核酸医薬系の構築に取り組んだ。虚血性疾患選択的核酸医薬系構築においては、当初計画していた通り、PRNAに対するフェニルボロン酸誘導体導入に成功し、pH変化に基づくanti-syn核酸塩基部配向制御を円二色性スペクトル解析により実証した。さらに、様々な置換基導入によりanti-synスイッチングpH(pKs)がハメット則に従い自在にチューニングできることを見出し、本結果は期待以上の成果である。さらに、PRNAとフェニルボロン酸誘導体との分子間ホウ酸エステル結合形成においては、pKsの濃度依存性があるのに対して、PRNA-フェニルボロン酸複合体からなる第二世代PRNAにおける分子内ホウ酸エステル結合形成においては、pKsは基質濃度に依存せず一定値を示すことをハメットプロットに基づき示すことができ、分子内フェニルボロン酸誘導体導入の有効性を示すとともに、細胞内においても第二世代PRNAが投与量に依存せず効果的に機能できる可能性が示唆された。触媒的核酸医薬系の構築においては、X線結晶構造およびモデル構造に基づき、DNA-アミド骨格人工核酸キメラ分子を設計・合成した。当初の計画通り、DNA-人工核酸アミドジャンクション部位での選択的RNA切断と高効率触媒的RNA切断の実証に成功した。さらに、様々なDNA-人工核酸キメラ分子誘導体を合成し、詳細な機能解析の結果、DNAへの人工核酸導入位置・構造の違いによって標的RNAの切断部位を自在に制御可能であることを見出した。本結果は、DNA-人工核酸キメラ分子が配列特異的RNA切断ツールや新規ゲノム編集法などへ応用可能であることを示す予想を遥かに上回る成果である。

今後の研究の推進方策

今年度は、ハメット則に基づく構造設計により脳梗塞選択的薬効発現が期待できるPRNAの開発に成功した。今後は培養細胞を用いた脳梗塞モデル系において、PRNAによるマイクロRNA阻害効果の検討を行う。具体的には、miR155に相補的なPRNAを設計・合成し、低酸素培養による細胞内pH低下に応じた阻害効果の変化について検討することで、PRNAによる薬効発現スイッチングを実証する。また、miR155の標的部位の最適化も重要な課題であり、ストランドインベージョン機構を利用した標的多様性の拡大にも取り組む。DNA-人工核酸キメラ分子の系においては、現在、培養細胞を用いた細胞内在性RNase Hによる標的mRNA切断に基づく翻訳阻害効果について検討しており、今後の展開が期待される。本系においては、in vivo実験への適用を見据え、より実用的な核酸医薬としての展開のため、3'-DNA末端に対して糖部架橋型核酸(LNA)の導入およびホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合へと改変したキメラ分子を設計・合成することにより標的核酸親和性とヌクレアーゼ耐性の向上を目指す。このようにして、最適化したPRNAフラグメントとDNA-人工核酸キメラ分子フラグメントをHuisgen双極子環化付加反応(CuAAC)により連結し、キメラPRNAコンジュゲートを合成する。キメラPRNAコンジュゲートの標的核酸との相互作用特性、ストランドインベージョン特性、標的RNA切断特性、タンパク質発現抑制活性についてin vitro系において評価したのち、培養細胞ならびにモデルマウスを用いて本方法論の実証に取り組む。

  • 研究成果

    (10件)

すべて 2019 2018

すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 2件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (7件) (うち国際学会 3件)

  • [雑誌論文] N-Benzoyl-protected Peptide Nucleic Acid (PNA) Monomers Expand the Range of Nucleobases Available for PNA-DNA Chimera2019

    • 著者名/発表者名
      Inagaki Masahito、Uematsu Ryohei、Mizutani Tatsuya、Unabara Daisuke、Araki Yasuyuki、Sakamoto Seiji、Kashida Hiromu、Nishijima Masaki、Asanuma Hiroyuki、Inoue Yoshihisa、Wada Takehiko
    • 雑誌名

      Chemistry Letters

      巻: 48 ページ: 341~344

    • DOI

      10.1246/cl.181048

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] ヌクレアーゼ活性向上を指向したDNA-人工核酸キメラ分子構造設計と新機能創製2019

    • 著者名/発表者名
      稲垣雅仁、和田健彦
    • 雑誌名

      生体機能関連化学部会NEWS LETTER

      巻: 33 ページ: 4~4

  • [雑誌論文] Peptide Ribonucleic Acid (PRNA)-Arginine Hybrids. Effects of Arginine Residues Alternatingly Introduced to PRNA Backbone on Aggregation, Cellular Uptake, and Cytotoxicity2018

    • 著者名/発表者名
      Sugai Hiroka、Nakase Ikuhiko、Sakamoto Seiji、Nishio Akihiro、Inagaki Masahito、Nishijima Masaki、Yamayoshi Asako、Araki Yasuyuki、Ishibashi Satoru、Yokota Takanori、Inoue Yoshihisa、Wada Takehiko
    • 雑誌名

      Chemistry Letters

      巻: 47 ページ: 381~384

    • DOI

      10.1246/cl.171186

    • 査読あり
  • [学会発表] Design and synthesis of intracellular condition responsive artificial nucleic acids for the catalytic oligonucleotide therapeutics2019

    • 著者名/発表者名
      Masahito Inagaki, Daisuke Unabara, Yasuyuki Araki, Satoru Ishibashi, Takanori Yokota, Takehiko Wada
    • 学会等名
      日本化学会第99春季年会
  • [学会発表] Creation of ischemia-selective oligonucleotide therapeutics system with intracellular environment-responsive Peptide Ribonucleic Acids (PRNAs)2018

    • 著者名/発表者名
      Masahito Inagaki, Daisuke Unabara, Ryohei Uematsu, Yasuyuki Araki, Seiji Sakamoto, Satoru Ishibashi, Takanori Yokota, Takehiko Wada
    • 学会等名
      The 5th CWRU-TOHOKU Joint Workshop
    • 国際学会
  • [学会発表] Novel Design Strategy of DNA-Peptide Ribonucleic Acid (PRNA) Chimeras Toward Control the RNase H Activities2018

    • 著者名/発表者名
      Masahito Inagaki, Daisuke Unabara, Ryohei Uematsu, Yasuyuki Araki, Masaki Nishijima, Satoru Ishibashi, Takanori Yokota, Takehiko Wada
    • 学会等名
      The 45th International Symposium on Nucleic Acids Chemistry, The 2nd Annual Meeting of Japan Society of Nucleic Acids Chemistry
    • 国際学会
  • [学会発表] 細胞内環境応答性ペプチドリボ核酸を利用した虚血細胞特異的核酸医薬の創製 -標的RNA選択的結合特性を有するヘミギャップマー型PRNA-DNAキメラ人工核酸による高効率触媒的アンチセンス核酸医薬の創製-2018

    • 著者名/発表者名
      稲垣雅仁、海原大輔、上松亮平、荒木保幸、坂本清志、石橋 哲、横田隆徳、和田健彦
    • 学会等名
      核酸医薬学会第4回年会
  • [学会発表] ヌクレアーゼ活性向上を指向したDNA-人工核酸キメラ分子構造設計と新機能創成2018

    • 著者名/発表者名
      稲垣雅仁、海原大輔、上松亮平、荒木保幸、西嶋政樹、石橋 哲、横田隆徳、和田健彦
    • 学会等名
      第12回バイオ関連化学シンポジウム
  • [学会発表] ヌクレアーゼ活性向上を指向したDNA-人工核酸キメラ分子の新規分子構造設計と触媒的核酸医薬への展開2018

    • 著者名/発表者名
      稲垣雅仁、海原大輔、荒木保幸、西嶋政樹、石橋 哲、横田隆徳、和田健彦
    • 学会等名
      第18回多元物質科学研究所研究発表会
  • [学会発表] Creation of ischemia-selective oligonucleotide therapeutics system with intracellular condition-responsive Peptide Ribonucleic Acids (PRNAs): Design and synthesis of PRNAs and its chimeras for the RNase H mediated catalytic oligonucleotide therapeutics2018

    • 著者名/発表者名
      Masahito Inagaki, Daisuke Unabara, Ryohei Uematsu, Yasuyuki Araki, Masaki Nishijima, Satoru Ishibashi, Takanori Yokota, Takehiko Wada
    • 学会等名
      XXIII International Roundtable on Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids
    • 国際学会

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公開日: 2019-12-27  

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