| 研究課題/領域番号 |
18J20409
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
鳥越 祥太 大阪大学, 医学系研究科, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-25 – 2021-03-31
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| キーワード | C型レクチン受容体 / 結核菌 |
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| 研究実績の概要 |
これまでに結核菌に対するパターン認識受容体として活性化型C型レクチン受容体が報告されているが、抑制型C型レクチン受容体が結核菌を認識するか否かは報告されていない。そこで抑制型受容体による結核菌認識をレポーター細胞で調べたところ、ヒトMyeloid inhibitory C-type lectin (MICL) が結核菌の親水性成分を認識することが明らかになった。本研究は、結核菌感染時における抑制型C型レクチン受容体であるヒトMICLの役割を明らかにすることを目的にしている。
結核菌の親水性成分中に含まれるヒトMICLリガンドを絞り込むために酵素処理してレポーター活性を調べたところ、プロテアーゼで著しくリガンド活性が低下した。このことから、ヒトMICLリガンドはタンパク質である可能性が示唆された。またコンカナバリンAカラム結合分画にリガンド活性が存在していたことから、リガンド成分はマンノースもしくはグルコースなどの糖成分をもつことが示唆され、リガンドは糖タンパク質である可能性が考えられた。
ヒトMICLを発現しているヒト単球由来細胞株であるTHP-1を用いて結核菌刺激による炎症性サイトカインの条件検討を行った結果、用量依存的にIL-8が産生されることがわかった。レポーター細胞でヒトMICLの結核菌リガンドの認識に対するブロッキング活性がある市販の抗ヒトMICL抗体も調べており、結核菌刺激時におけるヒトMICLの機能を調べる上での条件検討ができた。
in vivo解析のためにヒトMICLノックインマウスを樹立したがヒトMICLを発現していなかった。そこで代替案であったpCAGGSベクターにヒトMICLのcDNAを挿入したプラスミドを作成し、ヒトMICLトランスジェニックマウスを樹立した。このマウスの血球系細胞ではヒトMICLが発現していることを確認できた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ヒトMICLを発現している単球由来細胞株であるTHP-1ならびにヒトMICLレポーター細胞を用いて、結核菌に対する免疫応答の指標となる炎症性サイトカインの産生と抗ヒトMICL抗体のリガンド認識阻害活性を調べ、in vitroでの機能解析のための条件検討を行うことができた。またin vivoの解析のためにヒトMICLノックインマウスの樹立を試みた。ミエロイド細胞表面での受容体発現が確認できなかったが、代替案であったヒトMICLトランスジェニックマウスをpCAGCSベクターを用いて樹立し、血球系細胞表面での受容体発現を確認した。
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| 今後の研究の推進方策 |
樹立したヒトMICLトランスジェニックマウスを用いて骨髄由来樹状細胞やマクロファージもしくはプライマリーのミエロイド細胞を用いて、結核菌刺激によって産生される炎症性サイトカインを指標にして、親水性成分に免疫抑制の寄与があるかを調べる。
またヒトMICLを発現するTHP-1を粗精製結核菌親水性成分で刺激すると、炎症性サイトカインであるIL-8を産生する。これを指標にして、抗ヒトMICL抗体存在下でのIL-8の産生量の変化を調べる。結核菌親水性成分でIL-8の産生量に差異が見られた場合は、結核菌体で刺激を行い、結核菌感染時においても影響を与えうるかどうかin vitroで検証する
これらの解析に加え、結核菌親水性成分に中に含まれる免疫活性化に寄与する受容体の同定ならびに機能解析を行う。
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