| 研究課題/領域番号 |
18J20898
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
小畑 大地 北海道大学, 生命科学院, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-25 – 2021-03-31
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| キーワード | STAY-GREEN / クロロフィル分解 / 触媒機構 / アミノ酸置換 / 酵素 / 代謝系 / 進化 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、クロロフィル分解系の最初の反応を触媒するMg脱離酵素SGRとそれと相同なSGR-LIKE（SGRL）の①Mg脱離機構、②基質認識機構、③クロロフィル分解が支配する植物の老化メカニズム、④クロロフィル分解系の進化の4点を明らかにする計画である。本年度は、①と④に着目して研究を行った。
①SGRは配位結合の切断という新規の触媒反応を担う酵素であり、その触媒機構の解明は酵素学的に重要な知見となる。しかしSGRは類似の構造すら報告がなく、活性測定は高価であり、様々な面で解析が困難であった。本研究では、SGRの活性測定系を改良し、大腸菌を用いた簡便で安価な実験系を確立し、シロイヌナズナSGRLのアミノ酸置換による触媒機構の解析に成功した。これにより、Mg脱離反応は、活性中心に位置する2つの酸性アミノ酸残基がクロロフィルaのMg-N間にH+を供与しての配位結合を切断するというモデルを提案した。
④また、予期せず、非光合成細菌にもSGRのホモログが存在するという興味深い発見をし、それらの中にはSGRのMg脱離活性を超えるものがあると明らかにした。そして、この高いMg脱離活性を持つホモログが緑色植物へ水平移動してきたことでクロロフィル分解酵素SGRが誕生したという説を提唱した。SGRホモログの宿主にはクロロフィルが存在しないため、Mg脱離活性は生理的に無意味な活性である。このような活性は低く保たれているという説が主流であり、先行研究における酵素の無意味な活性による代謝系の進化においてもそれが前提である。これに対して、我々は「高い」無意味な活性の存在を示し、水平移動との組み合わせによって酵素と代謝系が進化することを、SGRを例に提唱した。このような進化シナリオはこれまでに報告がなく、特に遺伝子の水平移動が主な進化の原動力である原核生物の代謝系の進化をこれまで以上によく説明できる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
申請時の計画では、本年度は①Mg脱離機構と②基質認識機構に関する実験を行う予定であったが、予期せぬ発見があったことから、①と④クロロフィル分解系の進化について実験を進めた。
①クロロフィルは酸によるH+供与でMgを脱離するため、SGRの触媒には酸性アミノ酸残基が関与すると予想した。触媒に関わると考えられる酸性アミノ酸残基が見つかるも、アミノ酸置換体の活性が低すぎて個々のアミノ酸残基の機能が決定できずにいた。タンパク質の可溶化を促進するようなタグを用いたことで、より高いMg脱離活性を得られるようになり、アミノ酸置換体の活性も安定して測定できるようになった。これより2つの酸性アミノ酸が活性中心で触媒を担っていることが示唆され、これらの酸性アミノ酸残基がH+を供与することで、クロロフィルaのMg-N間の配位結合を切断するというモデルを立てた。現在更なる実験を行い、このモデルを支持するデータを集めている。
④クロロフィルを持たない非光合成細菌にもSGRのホモログが存在するという興味深い発見がなされた。系統解析からは、非光合成細菌SGRホモログが水平移動を介して緑色植物の共通祖先に獲得され、Mg脱離酵素SGRが進化・誕生したことを示唆された。さらに驚くことに、SGRホモログの中には緑色植物SGRのMg脱離活性を超えるものがあると判明した。クロロフィルを持たないバクテリアにおいて、Mg脱離活性は生理学的な意味がない。先行研究では「生理的に無意味な活性＝低い」ことが考えられていた。これに対して、我々はSGRおよび緑色植物のクロロフィル代謝系を例として、酵素の無意味な活性には高いものも存在し、水平移動と組み合わさることで酵素と代謝系が進化するという新しい進化シナリオを提唱した。これについては現在論文投稿中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は①Mg脱離機構に関する研究を完成、論文投稿を目指す。アミノ酸置換体の活性測定の結果を補強するために、酵素反応速度論的解析によるKm値の変化や差吸収スペクトル法（色素がタンパク質と相互作用すると吸収波長がずれることを利用し、特定の色素の状態を観察する手法）による基質と酵素の相互作用の変化を解析する。
また、本年度行わなかった②SGRとSGRLの基質認識機構の研究を進めていくつもりである。SGRとSGRLは同じMg脱離反応を触媒するが、基質特異性が異なる。基質認識機構を調べることで、個々のアミノ酸残基の役割を調べるとともに、基質特異性の進化の軌跡を追う。SGRとSGRLでそれぞれ独立に保存されているアミノ酸残基あるいはドメインを探索し、対応する場所を入れ替えるなどして基質特異性に与える影響を調べる。この実験には④の実験で得られた情報も重要となってくる。Mg脱離活性を持っていた非光合成細菌SGRホモログはSGRとSGRLが分解できないクロロフィル分子も基質として分解することできる。ここでまた1つ異なる基質特異性をもつクロロフィル－Mg脱離酵素を得たため、これも加えて基質認識機構の解析を行う予定である。
さらに、④の研究中にSGRホモログを持ち、かつ、タンパク質の大量発現にも利用されている細菌（Bacillus megaterium）を見つけため、この細菌を利用したSGRの新しい発現系の立ち上げも計画している。発現量によってはSGRの結晶構造解析も視野に入れる。
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