| 研究課題/領域番号 |
18J21038
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
吉村 淳 名古屋大学, 生命農学研究科, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-25 – 2021-03-31
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| キーワード | Siglec-7 / 糖鎖免疫 / 糖鎖認識 / シアル酸 |
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| 研究実績の概要 |
Siglec-7はヒトNK細胞や単球に発現するSiglecの一つであり、シアル酸との結合を介して免疫を制御する。本研究では、Siglec-7の複雑なシアル酸認識機構とその免疫制御機構の解明を目指し研究を進めた。これまでの研究により、以下の知見を得た。
(1) Siglec-7の構造-結合相関研究：Siglec-7のアミノ酸置換変異体タンパク質を調製し、ELISA法により既知のリガンドである糖脂質への結合性を評価し、新奇シアル酸結合部において重要なアミノ酸残基を見出した。また、異なるリガンドに対する結合性を解析することにより、今回新たに発見した変異体は既知の結合部位におけるアミノ酸置換変異体とは異なる結合性を示すことが分かり、結合部位特異的なリガンドが存在することが推察された。
(2) Siglec-7のリガンドの同定：複数種の培養細胞を用いてSiglec-7のリガンドを探索したところ、特定の細胞種が糖タンパク質としてリガンドを発現していることを見出した。それらの細胞由来のタンパク質に対してSiglec-7を用いた親和性精製を行い、効率的にリガンドを精製する方法を確立した。今後は質量分析によりそのリガンド分子を同定していく。また、リガンド糖鎖の生合成機構を解明するため、シアル酸転移酵素に焦点を絞り各細胞種における発現プロファイルを比較し、候補となる遺伝子を予想した。それらシアル酸転移酵素を細胞に発現させSiglec-7の結合性を解析し、リガンド糖鎖の生合成に関与するシアル酸転移酵素を新たに同定した。
(3) 外来リガンド糖鎖の作用機構：合成したSiglec-7の高親和性化合物が免疫制御に与える効果を検証するために、マウスのマクロファージ細胞を用いて炎症反応を解析した。その結果、化合物はSiglec-7の有無に関わらずリポ多糖誘導性の炎症には影響を及ぼさないことが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究内容としては進んでいるが、研究成果として学会発表や雑誌投稿等ができていないため。
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| 今後の研究の推進方策 |
(1)Siglec-7の構造-結合相関研究：同定されたSiglec-7のリガンドに対して、前年度に作製した変異体Siglec-7の結合性を評価する。その知見をもとに、新奇の結合サイトと既知の結合サイトそれぞれに高親和性のリガンドを見出す。各変異体とリガンドを用いて、速度論的解析によって詳細な結合様式の違いを明らかにする。
(2)Siglec-7のリガンドの同定：今後、精製分子を質量分析法によって絞り込んでいく。CRISPR/Cas9システムを基礎としたゲノム編集技術を用いて、質量分析により候補とした分子の遺伝子をノックアウトした細胞を作出し、Siglec-7の結合性を評価する。
(3)Siglec-7シグナリングの解析：Siglec-7のシグナル伝達経路を解明するために、シグナル伝達の強さに依存してGFPやルシフェラーゼを発現するレポーターアッセイ用の免疫細胞を作出し、Siglec-7が影響を与えるシグナル経路を明らかにする。
(4)外来リガンド糖鎖の作用機構：株化されたヒトNK細胞を用いてSiglec-7と高親和性を持つ合成化合物の効果を細胞傷害性実験により明らかにする。さらに、(2)で作出したリガンド候補のノックアウト細胞を用いて、Siglec-7と化合物の効果のリガンド依存性を詳細に調べる。
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