時計タンパク質複合体による概日リズム発信機構の解明

2019 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 18J21063
• 研究機関: 名古屋市立大学
• 研究代表者: 柚木 康弘 名古屋市立大学, 薬学研究科, 特別研究員(DC1)
• 研究期間 (年度): 2018-04-25 – 2021-03-31
• キーワード: 時計タンパク質 / 超分子質量分析 / 核磁気共鳴法 / シアノバクテリア

研究実績の概要

本年度は、SAXS (X線小角散乱) やSANS(中性子小角散乱) を活用し、KaiA-KaiB-KaiC三者複合体 (ABC複合体) を対象に、全体構造を明らかにすることを試みた。超遠心質量分析およびゲル濾過クロマトグラフィー (SEC)によって、ABC複合体がKaiA:KaiB:KaiCが12:6:6の化学量論で複合体を形成していることが明らかとなったが、ABC複合体の構造が不安定であるために溶液散乱測定を通じて正確な構造情報を得ることが困難であった。そこで、SECカラムを搭載した装置と溶液散乱装置をオンラインで連結したSEC-SAXS/SANS法を利用し、これにより凝集成分の影響の排除に成功した。こうして、SEC-SAXSおよびSEC-SANSから得られた構造情報をもとに、KaiABC複合体の立体構造モデルの構築に至っている。
サブユニット交換に関しては、特に、6つサブユニットのリン酸化状態が不均一となるようなKaiCを対象として超分子質量による検討を行なった。しかしながら、KaiC複合体が不均一な分子集団となることにより超分子質量スペクトルの解析が困難を極めた。そこで、サンプルの不純物を徹底的に除くことで、相対的なKaiCのシグナル強度の改善を図り、さらには、価数の異なる複数の多価イオンピークとして検出された質量スペクトルを分子の質量に変換することで質量シグナルを定量的に解析する基盤を整えた。。こうした解析技術をもとに2種類のリン酸化変異体を混ぜ合わせることで不均一なKaiCを調製し超分子質量計測に供したが、サブユニット交換は認められなかった。今後は、KaiA、KaiB存在下でリン酸化の概日リズムを刻んでいる野生型のKaiCを対象に、サブユニット交換の実態を捉えることを計画している。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

昨年度までに、超分子質量分析・溶液散乱法・核磁気共鳴法を利用し、リン酸化状態とヌクレオチド状態の違いがもたらすKaiCの構造変化を捉え、Kaiタンパク質間の相互作用様式を明らかにすることに成功していた。今年度は本研究成果をもとにさらに詳細なデータを加え、KaiCとKaiAの相互作用様式を解明した論文 (Life Sci Alliance. 2019, 3, 201900368.)およびKaiBとKaiCの相互作用による概日リズムの制御を明らかとした論文 (Int J Mol Sci. 2019, 13, 4550.) の2報を誌上発表した。
こうした成果に加えて、ゲル濾過クロマトグラフィーと溶液散乱を組み合わせることで、Kaiタンパク質複合体の全体構造を捉えるとともにそれを構成する各サブユニットの構造情報を抽出することに成功した。これまでのところサブユニット交換の実態は依然として捉えられていないものの、KaiC 6量体の不均一なリン酸化状態を模倣する実験系の構築に成功し、KaiC分子に対するKaiAやKaiBとの相互作用の実態も明らかにしつつある。
以上を総合して、研究が順調に研究は進展しているものと判断した。

今後の研究の推進方策

昨年度に確立したプロトコルに基づいて2種類のリン酸化変異体を混ぜ合わせることで不均一なリン酸化状態を模したKaiCを調製する。その際、変異体のバリエーションを昨年よりも増やし、概日リズムの周期の中で生じ得るリン酸化状態を網羅することを目指す。これを用いて安定同位体標識化技術を利用した超分子質量分析・溶液散乱法・核磁気共鳴法の計測を実施し、KaiAおよびKaiBとの相互作用の実態に迫ることを計画している。
一方、昨年度確立した溶液散乱クロマトグラフィー法を応用してKaiABC複合体を構成する各サブユニットの構造情報を抽出する。分子シミュレーションによって得られる立体構造ダイナミクスの情報と合わせて、水溶液中におけるKaiABC複合体の全体構造を明らかにする。超分子質量分析と核磁気共鳴法を利用することに得られる情報を統合して、KaiC 6量体のリン酸化状態やヌクレオチド状態といったミクロ環境の変化とKaiタンパク質間の相互作用との関連を明らかにする。
さらに、KaiAおよびKaiBの存在下でリン酸化の概日リズムを刻んでいる野生型のKaiCを対象に超分子質量計測を実施することでサブユニット交換を捉えることを計画している。
以上の知見に基づいて、概日リズムを制御するKaiタンパク質間相互作用の分子メカニズムを明らかにすることを目指す。

研究成果

• [雑誌論文] ATP hydrolysis by KaiC promotes its KaiA binding in the cyanobacterial circadian clock system. (2019)
  • 著者名/発表者名: Yunoki Y, Ishii K, Yagi-Utsumi M, Murakami R, Uchiyama S, Yagi H, Kato K.
  • 雑誌名: Life Science Alliance 巻: e201900368 ページ: 1, 7
  • DOI: 10.26508/lsa.201900368.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Cooperative Binding of KaiB to the KaiC Hexamer Ensures Accurate Circadian Clock Oscillation in Cyanobacteria. (2019)
  • 著者名/発表者名: Murakami R, Yunoki Y, Ishii K, Terauchi K, Uchiyama S, Yagi H, Kato K.
  • 雑誌名: International of Molecular Biology 巻: E4550. ページ: 1, 10
  • DOI: 10.3390/ijms20184550.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] KaiC ATP hydrolysis controls its binding to Kai proteins in the cyanobacteria circadian clock system. (2020)
  • 著者名/発表者名: Yasuhiro Yunoki, Kentaro Ishii, Maho Yagi-Utsumi, Reiko Murakami,Atsuji Kodama, Kazuki Terauchi, Susumu Uchiyama, Hirokazu Yagi, Koichi Kato
  • 学会等名: Yasuhiro Yunoki, Kentaro Ishii, Maho Yagi-Utsumi, Reiko Murakami,Atsuji Kodama, Kazuki Terauchi, Susumu Uchiyama, Hirokazu Yagi, Koichi Kato
• [学会発表] Solution structure of the circadian clock protein complex characterized by a combination ap-proach involving solution scattering and computational methods (2020)
  • 著者名/発表者名: 柚木康弘、矢木宏和、守島 健、松本 淳、佐藤信浩、Lionel Porcar、Anne Martel、井上倫太郎、寺内一姫、河野秀俊、加藤晃一、杉山正明
  • 学会等名: 京大複合原子力科学研究所第54回学術講演会
• [学会発表] 時計タンパク質KaiCによるATP加水分解に依存したKaiタンパク間相互作用の制御メカニズムの解明 (2019)
  • 著者名/発表者名: Yasuhiro Yunoki, Hirokazu Yagi, Maho Yagi-Utsumi, Kentaro Ishii, Reiko Murakami, Susumu Uchiyama, Koichi Kato
  • 学会等名: 第20回若手NMR研究会
• [学会発表] ATP hydrolysis by KaiC regulates its binding to Kai proteins in the cyanobacterial circadian clock system (2019)
  • 著者名/発表者名: 柚木康弘、石井健太郎、矢木真穂、村上怜子、寺内一姫、内山 進、矢木宏和、加藤晃一
  • 学会等名: 第26回日本時間生物学会学術大会
• [学会発表] Native mass spectrometric analysis of the interplay among circadian clock proteins (2019)
  • 著者名/発表者名: 柚木康弘、兒玉篤治、石井健太郎、矢木真穂、村上怜子、寺内一姫、内山 進、矢木宏和、加藤晃一
  • 学会等名: 第2回ExCELLSシンポジウム