2018 年度実績報告書

臓器線維症におけるPDGFRα陽性間質細胞の役割

研究課題

研究課題/領域番号	18J21327
研究機関	東京大学
研究代表者	黒澤珠希東京大学, 農学生命科学研究科, 特別研究員(DC1)
研究期間 (年度)	2018-04-25 – 2021-03-31
キーワード	線維症 / PDGFRα / 間質
研究実績の概要	コラーゲンや線維芽細胞の増加による組織の線維化は、急性の創傷治癒において正常な反応である一方、慢性炎症や老化の果てに生じる過剰な線維化は臓器本来の機能をも損なう。社会の高齢化に伴い、各線維症は医療が克服すべき主たる課題となったにも関わらず、線維症に対する根本的な治療法は未だ存在しない。近年、骨格筋において血小板由来増殖因子受容体α(PDGFRα)を発現する間質細胞が間葉系幹細胞(MSC)様の前駆細胞能を有しており、筋組織における脂肪細胞ならびに線維芽細胞の起源であることが報告された。さらに、PDGFRα陽性細胞は全身の様々な正常臓器の間質に存在し、各臓器線維症に関与することが明らかとなってきた。しかしながら、①さまざまな組織に存在するPDGFRα陽性細胞が同一の細胞特性を持つのか、②各臓器の線維化に際して本細胞と他の周辺細胞との間にどのような相互作用があるか、③各線維症の発症におけるPDGFRα陽性細胞の働きに違いがあるか、またそれを阻止する手段があるか、といった細胞学的および病態生理学的な臓器間差異は不明である。本研究では全身のさまざまな臓器におけるPDGFRα陽性細胞の特性を解析することで、各線維症に対する治療戦略の基盤構築を目指す。本研究ではまず初めに、さまざまな臓器における同細胞の分布を明らかにするため、各臓器における同細胞の免疫染色を行った。続いて各臓器におけるPDGFRα陽性細胞の特性を探るため、FACS細胞分取法を用いていくつかの臓器からPDGFRα陽性細胞を単離し、その遺伝子発現を網羅的に比較解析した。また同細胞と周辺細胞との相互作用を調べるため、本年度は骨格筋における他の臓器構成細胞として筋繊維の起源であるサテライト細胞を細胞分取し、同細胞との共培養による相互作用解析を実施した。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由【FACS/細胞分取法を用いた各臓器に存在するPa陽性間質細胞の特性】本年度は肺、心臓、肝臓、皮下脂肪、骨格筋、小腸筋層および小腸粘膜層に存在する各Pα陽性間質細胞をFACSによって単離する系を確立した。単離には内皮細胞マーカーとしてCD31、汎血球系マーカーとしてCD45を用い、解析の結果、各臓器に存在するPα陽性細胞は一様にCD31-/CD45- の集団であることが明らかとなった。確立した手法を用いて分取した細胞からはRNAを抽出し、RNA-Seq解析を実施した。【Pα陽性間質細胞の病態生理機能】本年度はまず健常個体の肺、心臓、肝臓、皮下脂肪、骨格筋、小腸におけるPα陽性間質細胞の病理学的な分布を解析するため、各組織の固定法を検討し免疫染色を実施した。結果Pα陽性間質細胞はさまざな臓器において血管周囲に多く存在していた。この結果を受けて、Pα陽性間質細胞とその周辺細胞との位置関係をより詳細に解析するため、XYZ方向の空間的位置関係を維持した観察を可能にする厚みを持った組織の透明化標本作製ならびに観察方法の確立に取り組んだ。透明化試薬であるTDE (2,2’-Thiodiethanol) を用いて心臓、肝臓、骨格筋、小腸を透明化し、免疫染色によって各臓器におけるPα陽性間質細胞、血管、および神経細胞の位置関係を観察した。【Pα陽性間質細胞と他の臓器構成細胞との細胞間相互作用】Pα陽性間質細胞と他の細胞との相互作用を調べるため、本年度は骨格筋における他の臓器構成細胞として筋繊維の起源であるサテライト細胞をFACS分取する系を確立した。この系を用いて分取したサテライト細胞とPα陽性間質細胞を共培養したところ、筋管形成が著しく促進した。これを受けて、本現象を司る細胞間相互作用を持つ物質を探索するため、共培養した両細胞における遺伝子発現解析を行った。
今後の研究の推進方策	【FACS/細胞分取法を用いた各臓器に存在するPa陽性間質細胞の特性】来年度はRNA-Seq解析結果をもとに、肺、心臓、肝臓、皮下脂肪、骨格筋、小腸筋層および小腸粘膜層に存在するPα陽性間質細胞の発現遺伝子比較を行う予定である。また前年度までに確立したFACS細胞分取法を用いて、線維化または老化した各臓器からも同細胞を単離し、遺伝子発現の網羅的比較解析を実施する。【Pα陽性間質細胞の病態生理機能】確立した手法を用いて各臓器を構成する主要な細胞とPα陽性間質細胞との位置関係の解析を進める。また病態生理機能解析に関して、PDGFRα-CreERT2ノックインマウスを使用した同細胞の運命追跡を予定している。【Pα陽性間質細胞と他の臓器構成細胞との細胞間相互作用】Pα陽性間質細胞とサテライト細胞の２細胞間における相互作用を探索することを目的として、前年度までに実施したRNA-Seq解析結果をもとに、リガンド-レセプターペアの抽出、ならびに単独培養と共培養における発現遺伝子の比較解析を行う。