| 研究課題/領域番号 |
18J21373
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| 研究機関 | 筑波大学 |
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研究代表者 |
永沢 亮 筑波大学, 生命環境科学研究科, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-25 – 2021-03-31
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| キーワード | 細胞外DNA / 細胞死 / タイムラプスイメージング |
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| 研究実績の概要 |
細菌のバイオフィルム形成において、細胞外DNAが付着・接着因子として機能することが明らかとなっている。う蝕の主要原因細菌であり、古くからバイオフィルム研究の一つのモデル細菌として研究されてきたStreptococcus mutansにおいても細胞外DNAがバイオフィルムの形成や構造安定性に寄与することが報告されている。細胞外DNAが死細胞由来のゲノムDNAであることは想像に難しくないが、実際にDNAの放出過程を観察した例はない。本研究は、顕微鏡技術による生命現象のイメージングとその現象の根底にあるメカニズムを遺伝子レベルで明らかにすることを目的としている。
今年度は、イメージング技術の確立を中心に研究を行った。増殖中に一部の細菌で起きる細胞死を一細胞レベルで検出するタイムラプスイメージング法を確立するため、培養条件および観察条件を検討した。生細胞と死細胞を識別するためには、蛍光顕微鏡観察が必要となるが、蛍光染色が細菌の増殖に与える影響を少なくするため、生細胞は蛍光染色せずに観察することを目指した。菌体を寒天培地上に接種し、培養後に観察したところ、細胞同士が重なり合い立体的なコロニーを形成したため、一細胞レベルでの解析は難しいと考えられた。そこで、マイクロチャンバーを用いて、増殖可能な空間を物理的に制限することで細胞同士が重なり合うことを防ぎ、平面的に増殖させることに成功した。また、培地に細胞膜非透過性の核酸蛍光標識試薬を添加して培養することにより、細胞死及び細胞外に放出される核酸の観察にも成功し、細菌の細胞死には，核酸を細胞外に放出するものと細胞形態を維持し核酸を放出しないものが存在することを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究課題では、生命現象の可視化とメカニズム解析を目的としている。タイムラプスイメージングにより、細胞死及び細胞外DNA産生を観察することに成功し、細菌の細胞死には内容物を放出するものとしないものとが存在することが明らかとなった。こうした細胞死のバリエーションは、タイムラプスイメージングを行うことで初めて明らかとなったことである。イメージング技術を既存の定量的な解析と組み合わせることにより、生命現象をより詳細かつ正確に解析できると考えられる。また、これまでに細胞死に関与することが明らかとなっている遺伝子や細胞死に関与すると推定されている遺伝子の欠損株、プロモーターレポーター株を作製した。解析に必要な供試菌株及び手法の確立ができ、実際に解析を進めていく準備を整えることができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成30年度に作製した供試菌株を使用し、タイムラプスイメージングを行い、これまでに細胞死との関連が指摘されている遺伝子が実際に細胞死のどの過程にどのように関与しているのかを明らかにしていきたい。
また、細胞死に関わる新規因子の探索を行うために、遺伝的に均一な集団内に見られる表現型の異なる細胞をセルソーターを用いてそれぞれ分取し、遺伝子発現の網羅的な解析を行いたいと考えている。
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