| 研究課題/領域番号 |
18J21514
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| 研究機関 | 東京農工大学 |
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研究代表者 |
上野 絹子 東京農工大学, 大学院工学府, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-25 – 2021-03-31
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| キーワード | アプタマー / 合成生物学 / RNAポリメラーゼ |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、微生物を用いた物質生産において目的物質が生産されたタイミングで菌体が自律的に溶菌し、目的物質の回収を容易に行うことができる制御系の開発を目指している。具体的には、ファージ由来 RNAポリメラーゼの活性を制御可能なRNA配列である酵素活性制御アプタマーを開発し、薬剤生産やバイオ燃料関連化合物の生産へ応用が試みられているシアノバクテリアに対して導入することで効率的な物質生産技術の開発を試みる。令和元年度では、大腸菌におけるRNAポリメラーゼ活性の評価条件の検討およびRNAポリメラーゼ阻害アプタマーの評価を行なった。
複数のファージ由来 RNAポリメラーゼについて、既報のプロモーター配列のそれぞれについて評価を行った。GFP遺伝子を含む3種類のベクターおよび各種RNAポリメラーゼを含むベクターを用いて評価を行なった結果、ファージ由来RNAポリメラーゼのそれぞれに対応するプロモーター配列の最適化に成功した。次に同様の手法により、各種RNAポリメラーゼに対するアプタマーの機能を評価したところ、細胞内においてアプタマーを転写させた場合には蛍光強度の減少が確認された。これより微生物内においてRNAポリメラーゼおよびRNAアプタマーを組み合わせた遺伝子発現制御系の開発が行える可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度の成果としては次の2点があげられる。最初に、選択した種々のRNAポリメラーゼを用いた細胞内における評価系を確立できたことが挙げられる。培養条件などの細かい実験条件および用いるプロモーター配列の最適化を行うことで、新規RNAポリメラーゼが遺伝子発現制御ツールとして有用であることが確認できた。また、同様にして細胞内におけるRNAアプタマーの阻害能を評価する実験系を確立できたことが実績としてあげられる。
以上の2点の成果より、本研究は現段階において概ね順調に進んでいると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の実験の推進方策としては以下の3点を軸に進めていく予定である。最初に、シアノバクテリアにおいて種々のRNAポリメラーゼを導入し、遺伝子発現制御ツールとしての機能解析を行う。次に、これまでに獲得された酵素活性制御アプタマーおよびRNAポリメラーゼを組み合わせ、シアノバクテリアにおける新規遺伝子発現制御ツールの開発を行う。最後に、アプタマー配列の最適化を行うことでシアノバクテリアにおける溶菌遺伝子の自律的な発現制御を試みる。以上の3点について評価を進めることで、酵素活性制御アプタマーを介した新規遺伝子発現制御技術の構築を試みる。
ただ、コロナウイルス感染拡大防止のための大学閉鎖期間が影響し、令和2年度における第1四半期には研究遂行に大きな支障が出ると考えられる。その際には研究計画を変更し、シアノバクテリアにおける新規RNAポリメラーゼの機能評価を優先する予定である。また、エラープローンPCR法などを用いたアプタマースクリーニングを複数の細胞における評価を同時並行で行うことで、短期間での酵素活性制御アプタマーの配列最適化を試みる予定である。
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