急性骨髄性白血病細胞が獲得するチロシンキナーゼ阻害剤耐性化機序の解明

2018 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 18J22436
• 研究機関: 順天堂大学
• 研究代表者: 山谷 琴子 順天堂大学, 医学研究科, 特別研究員(DC1)
• 研究期間 (年度): 2018-04-25 – 2021-03-31
• キーワード: 急性骨髄性白血病 / FLT3遺伝子変異 / 薬剤耐性 / アポトーシス

研究実績の概要

急性骨髄性白血病(AML)では、受容体型チロシンキナーゼFms-Like Tyrosine Kinase 3 (FLT3) の恒常的活性化をもたらすFLT3遺伝子変異が知られており、治療標的となっている。しかし、FLT3キナーゼ領域の点突然遺伝子変異が高頻度に発生して治療抵抗性が生じることが明らかになり、この獲得耐性の克服が課題となっている。本研究では、白血病細胞のFLT3遺伝子変異に伴う二次性のTKI耐性獲得の分子機構を解明し、新たな治療戦略の提案を目的とする。
当該年度の研究では、トランスクリプトーム解析であるCAGE(Cap Analysis of Gene Expression)解析を実施し、FLT3遺伝子の付加的変異の有無によって変化するゲノムワイドな変化を検出し薬剤耐性獲得の分子機構の鍵となる因子の特定を試みた。使用した検体は、患者由来細胞とBa/F3細胞株（マウス由来）で、チロシンキナーゼ阻害剤(TKI)感受性を示す細胞群と抵抗性を示す細胞群をそれぞれで比較検証した。その結果、抗アポトーシスに関連する遺伝子Aが有意に亢進していることが明らかとなった。遺伝子Aの働きを阻害する薬剤を使用し、細胞増殖抑制効果及びアポトーシス誘導効果を検証したところ、
抵抗性を示す細胞群で有意に細胞増殖抑制及びアポトーシスの誘導を認めた。
このことから、遺伝子Ａが薬剤抵抗性に寄与していることが示唆され、遺伝子Ａの働きを阻害する薬剤がTKI耐性を獲得したAML細胞で有効である可能性が示された。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

トランスクリプトーム解析であるCAGE解析を、AML患者サンプル及びBa/F3細胞株で行った。それぞれの細胞株でFLT3-ITD単独変異株とFLT3遺伝子の付加的変異を獲得した(TKI耐性)FLT3-ITD＋FLT3-D835Y重複変異株を比較し、ゲノムワイドの変化を検出した。AML患者サンプル及びBa/F3細胞株で共通してFLT3-ITD＋FLT3-D835重複変異株で高発現を認めた遺伝子が4つ検出された。我々はそれらの一つである遺伝子Ａについて検証を行った。Ba/F3細胞株での遺伝子Ａの蛋白発現をウェスタンブロット法で確認したところ、FLT3-ITD単独変異と比較し、FLT3-ITD＋FLT3-D835重複変異株で有意に発現が亢進していた。そこで、遺伝子Ａの阻害剤を使用し、細胞増殖抑制を検証したところ、FLT3-ITD＋FLT3-D835重複変異株での細胞増殖抑制を認めた。次にフローサイトメトリーにより遺伝子Ａの阻害剤のアポトーシス誘導効果を検証し、FLT3-ITD＋FLT3-D835重複変異株で有意にアポトーシスが誘導されていることがわかった。
以上より、FLT3-ITD＋FLT3-D835重複変異を有する白血病細胞における薬剤耐性に遺伝子Ａが関与している可能性および遺伝子Ａを阻害する薬剤の有効性を示すことができ、本年度は予定通りの達成度が得られたと考えられる。また、これまでの研究結果を、学会発表を通じて、成果を発信できている。

今後の研究の推進方策

今年度は、患者サンプルにおいて、CAGE解析で得られ遺伝子Ａ及びその他関連遺伝子の発現をPCR定量により再度確認する予定である。また、遺伝子Ａの発現や遺伝子Ａの阻害剤の効果をヒト白血病由来の細胞株(MV4-11)でも検証することを予定している。ヒト白血病細胞は共同研究者より提供されており、細胞株はFLT3-ITD、FLT3-ITD＋FLT3-D835H重複変異、FLT3-ITD＋FLT3-D835V重複変異を有している。それぞれの細胞株での遺伝子Ａの発現をPCR定量、Western blottingによる蛋白発現レベルを確認する。その後、遺伝子Ａの阻害剤効果を検証する。また、より臨床応用できるように遺伝子Ａの阻害剤と併用し、より相乗効果をもたらす薬剤の検討を行う。阻害剤の効果がヒト細胞でも得られた場合、in vivoでの遺伝子Ａの阻害剤の効果（併用薬剤も含め）を検証予定である。

研究成果

• [国際共同研究] MD Anderson Cancer Center(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: MD Anderson Cancer Center
• [学会発表] 急性骨髄性白血病細胞のチロシンキナーゼ阻害薬耐性獲得機構の解明 (2018)
  • 著者名/発表者名: 1)山谷琴子,齋藤香里，梁夏恩，一色美和，三井田孝，田部陽子
  • 学会等名: 第65回日本臨床検査医学会学術集会
• [学会発表] Upregulation of Bcl-2 confers resistance to FLT3 inhibition in FLT3-ITD AML with secondary acquired mutations. (2018)
  • 著者名/発表者名: 1)Kotoko Yamatani, Yoko Tabe, Kaori Saitoh, Haeun Yang, Yuko Murakami-Tonami, Koya Suzuki, Weiguo Zhang, Sonoko Kinjo, Kazuho Ikeo, Kaoru Mogushi, Masaki Hosoya, Shigeo Yamaguchi, Hironori Harada, Takashi Miida, Neil P. Shah, Marina Konopleva, Yoshihide Hayashizaki,Michael Andreeff
  • 学会等名: 60th American Society of Hematology (ASH) Annual Meeting and Exposition
  • 国際学会