| 研究課題/領域番号 |
18K04854
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| 研究機関 | 山口大学 |
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研究代表者 |
吉本 則子 山口大学, 大学院創成科学研究科, 准教授 (40432736)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | オリゴ核酸 / DNA / PEGylation / chromatography |
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| 研究実績の概要 |
核酸の二重鎖形成反応はポリエチレングリコール (PEG) を含有した溶媒中で促進され、分岐PEG 鎖を導入した核酸は二本鎖形成効率が著しく向上することが報告されている。このように、PEG により形成される局所的な溶媒環境が核酸分子鎖の電荷や疎水性を変化させ，分子鎖間の相互作用を促進することで、複雑かつ柔軟な高次構造と機能を獲得する可能性がある。しかし、これまでに，核酸の構造と機能に及ぼすPEG の修飾数および核酸分子鎖上の修飾位置の効果はほとんど解明されていない。このため本研究では、直鎖・分岐鎖を有するPEG 鎖が核酸の末端あるいは中間部に導入されたPEG化核酸の合成を行い、イオン交換クロマトグラフィー(IEC 担体)との相互作用機構に基づいて、それらの電荷分布を含む分子構造の解析を行い、さらに二本鎖形成能や各種分解酵素に対する構造安定性に基づき、構造と機能の関係を明らかにすることを目的としている。今年度は、分子量 5～20 kDa の直鎖・分岐構造をもつ PEG を，5～95 塩基数からなる合成オリゴヌクレオチドpoly A、G、C、Tの末端・中間部に修飾して，PEG 化 DNA の合成を行った。修飾後の分子サイズは修飾PEGの分子量とともに増大することがサイズ排除クロマトグラフィーによる分析により明らかとなった。一方で、IECによる解析の結果、塩基数の短いオリゴDNAではPEG鎖の修飾により表面電荷が減少するが、95塩基のものの場合、修飾の影響をほとんど受けないことが分かった。一方で、IEC担体との相互作用部位の数はPEG修飾後も変わらず、分子間の相互作用は弱まるものの結合能力は維持していることが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今年度の目標としているPEG化オリゴDNAの合成は概ね終了している。さらに、これらのイオン交換クロマトグラフィーを用いた解析についても、一般的な微粒子担体のみならず巨大分子用のモノリスクロマトグラフィーを用いて行い、細孔空間における結合構造の違いに関する検討も行った。また、PEG化DNAは修飾反応後の経過時間が長くなった場合、複数の構造体を形成する挙動することがサイズ排除クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーにより確認されたが、アニーリング処理により構造を単一化させ解析を行うことができた。一方でpolyG、polyCは凝集性が高くPEG化DNAと未反応DNAの分離が困難であり20塩基のもののみの合成と、その構造評価を行った。分子サイズの解析については動的光散乱法を用いた場合は、十分量のPEG化DNAが得られなかったため塩基数の短いDNAでは正確なデータを取得することができなかったが、サイズ排除クロマトグラフィーによる解析により分子サイズを同定することが可能となり、分子サイズと分子量の相関式を確立することができた。二本鎖形成能の評価についても、IECおよび蛍光法を用いた検討を着手しはじめているところである。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の予定としては、複数修飾部位を有するPEG化DNAの合成と今年度に合成したPEG化DNAの二重鎖形成能の評価を行うことである。複数の活性化基を導入したオリゴDNAを用い溶液中およびイオン交換担体界面上でのPEG修飾反応を行い、修飾反応の制御および高純度化の可能性について検討を行う。またイオン交換担体との静電相互作用は塩基数に依存するため，DNA が二重鎖を形成すると吸着サイト数が ほぼ2 倍になり溶出塩濃度が増加する。これを利用して相補的配列を有する PEG 化 DNA の混合，アニーリングにより二重鎖を形成させた後、IEC で 1 本鎖と 2 本鎖を分離して二重鎖形成率を測定する。検出感度を向上させるために、DNA 二重鎖と選択的に結合する蛍光プローブを使用する。さらにDNA 分解酵素ヌクレアーゼ共存下における PEG 化 DNA の安定性についても、各種クロマトグラフィーによる構造解析手法を用いて評価する予定である。
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