| 研究課題/領域番号 |
18K04908
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| 研究機関 | 中央大学 |
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研究代表者 |
津金 麻実子 中央大学, 理工学部, 共同研究員 (00469991)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 人工脂質膜小胞 / リポソーム / 膜融合 / 電気融合 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、ナノスケールの脂質二重膜小胞の電気融合を高効率に実現するための方法やデバイスを開発し、生体由来の小胞の検出や解析に活用することを目的としている。電気融合法は電気パルスという物理的刺激で膜融合を実現する汎用的方法である。ハイブリドーマ作製や細胞への物質送達などの重要な操作に利用されているが、マクロ電極を用いた原理的な限界からその適用範囲は直径5ミクロン以上の比較的巨大な膜構造に限定されていた。本研究ではマイクロ電極を用いて、エクソソームに代表されるナノスケール小胞の膜融合の実現に向けた基礎的条件を確立する。
2年目である本年度は、微細加工による電極とリポソームを保持するためのマイクロチャンバーを備えた電気融合用デバイスを設計・製作し、その性能を評価した。このデバイスは，小胞の融合効率向上を狙うとともに、融合率の定量的評価を改善するためのものである。シリコン製の電極と、シリコーンゴム製のマイクロチャンバーという二つの異なる製造プロセスを両立した製造方法を確立し、実際にリポソームの電気融合実験を行なった。その結果、テストケースとしての同一サイズ（直径5-20マイクロメートル程度）のリポソーム融合に関し、良好な結果を得た。また、別途検討したリポソームのサイズ調製法にも進捗があった。従来の高分子膜製メッシュに比べ、開口率が大きい金属製メッシュを用いることで、より簡便かつ高効率に望みのサイズ分布を持つリポソームの調製法を確立することができた。リポソーム研究の方法論としても有用なもので、データの取得と論文投稿準備を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
電気融合マイクロデバイスの具体的な作製方法について述べる。はじめに、カバーガラスに厚さ100マイクロメートルのシリコンウェハを接着させ、マイクロ深堀り加工を施すことで、電極を作製した。また、シリコーンゴム製のマイクロチャンバーと張り合わせることで、小胞保持機構の付与を実現した。開発した方法は、マイクロ加工の方法論としても新規性を有するものである。実際にリポソームを加えて電気融合を行なったところ、印加電圧に伴うドリフト流れの抑制に課題が見つかったが、いくつかの変更を加え、改善しつつある。本デバイスでは、微細加工時のデザインを変更することで、電極の間隔や形状、また、保持できるリポソームのサイズを容易に変更することができるため、今後の定量的なパラメトリックスタディが可能になる。また、上述のリポソームサイズ新規調製法を確立したことで、リポソーム融合のサイズ依存性をより詳細に調べることができる技術基盤が整った。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後はこのデバイスを用い、研究の主目的であるサイズの異なる小胞融合の効率評価を行う。具体的には、リアクターとしての巨大リポソーム（直径10マイクロメートル前後）をはじめにデバイスに加え、マイクロチャンバー内に沈ませることで位置固定する。次に、小サイズのリポソーム（直径1マイクロメートル以下）を追加する。この状態で融合用の電気信号を与えることで、膜融合を誘発するが、巨大リポソームがチャンバー内にあることで、それら同士の融合を抑制し、サイズが異なるもの同士の融合を評価することができる。また、巨大リポソームの位置が変わらないので、反応前後の様子をモニターでき、効率の定量評価につながる。融合率が低い場合は、必要に応じ、カルシウムイオンの添加など、リポソームの付着を積極的に促進する手順を加える。これらの基礎データを、生体由来膜に包まれた生理活性物質検出技術への展開につなげる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究計画においてマイクロ電極やマニュピレーターを購入予定であったが、本年度にシリコン製電極とマイクロチャンバーを備えた電気融合用デバイスの開発に着手し、その有用性が確認できた。それにより、マイクロ電極やマニュピレーターを用いた検討を行わなずとも研究の遂行が可能となり、これらを購入しなかったため、次年度使用額が生じた。この使用額は次年度に、電気融合デバイスの製造・改良に活用したいと考えている。
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