| 研究課題/領域番号 |
18K05174
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| 研究機関 | 高知大学 |
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研究代表者 |
渡辺 茂 高知大学, 教育研究部総合科学系複合領域科学部門, 教授 (70253333)
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| 研究分担者 |
松崎 茂展 高知大学, 医学部, 客員教授 (00190439) [辞退]
仁子 陽輔 高知大学, 教育研究部総合科学系複合領域科学部門, 助教 (20782056)
内山 淳平 麻布大学, 獣医学部, 講師 (20574619)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | バクテリオファージ / 金ナノ粒子 / 暗視野顕微鏡法 / 光散乱 / プラズモニクス |
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| 研究実績の概要 |
微生物検査は，感染症や食中毒の予防・衛生管理の面から重要である．しかし，培養に基づく従来法では検査に2～10日を要し，病原菌の特定に至っても手遅れになる場合が多く，検査の迅速化・簡易化が強く求められている．近年，PCRや抗原抗体反応を利用した迅速検査技術が開発されているが，遺伝子解析には煩雑な操作や高額な機器が必要である．また，細菌の中には，宿主免疫を回避するような防御機能を備えているものもあり，遺伝子解析や免疫反応に依らない新奇な検出原理が求められている．
バクテリオファージ（以下，ファージと省略する）は，細菌特異的に感染するウイルスの総称であり，標的細菌を特異的に識別する機能を備えている．その機能を自在に活用できるようになれば，遺伝子や免疫検出法に代わる迅速かつ簡便な細菌検出法への応用が期待できる．本年度は，ファージと金ナノ粒子を組み合わせた比色法に基づく細菌検出技術について検討した．
ファ―ジは，その表面のカルボキシル基を活性エステルへと変換した後，アミノエタンチオールと反応させることによってチオール化ファージへ変換した．次に細菌を含む試料と混合した後，遠心分離によって余剰のファージを取除き，金ナノ粒子の水溶液を添加した．黄色ブドウ球菌（S.aureus）を宿主とするファージを利用した場合，試料にS.aureusが含まれている場合，金ナノ粒子溶液の色は赤色から青色へと色調が変化する様子が観察された．一方，大腸菌属のE.coliや同じブドウ球菌属のS.Pseudintermediusを含む試料では色調変化は全く観察されなかった．本手法は，特別な分析機器を利用することなく，属のみならず種レベルで細菌を高選択的に検出することが可能であり，検出限界は数百cfu/mlに達することがわかった．また，利用するファージを変えることによって細菌選択性を自在に制御できる可能性がある．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
新型コロナウイルス感染症の拡大防止対策により，年度途中で研究活動の中断を余儀なくされた．また，共同研究者においても同様に研究活動が制限され，研究に必要な細菌等の試料が一時的に入手できなくなるなど，当初計画通りに実験を実施できなかった．
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| 今後の研究の推進方策 |
新奇な細菌検出用バイオ素材として，バクテリアファージの活用をめざす本研究では，3つの到達目標を掲げている．
【研究目標1】“ファージ機能制御技術”の開発：ファージは，細菌に感染し菌体を溶かして増殖するウイルスであり，ファージのライフサイクル（吸着，侵入，生合成，成熟，放出）の内，吸着機能のみ発揮させる方法について検討する．
【研究目標2】 “ファージ組織化技術”の開発：ファージの宿主特異性は尾部にあり，標的細菌に対して高い結合力を発揮するためには，ファージの配向を制御しながら組織化する必要がある．ファージの機能を最大限に発揮させる組織化技術を開発する．
【研究目標3】 “ファージナノプローブ”の開発：ファージの細菌認識現象を検出可能な物理信号に変換するバイオインターフェイスを開発する．
本年度は，研究目標3について機能化ファージと金ナノ粒子を組み合わせた比色法に基づく細菌検出法の原理実証を達成した．次年度は，その有用性を検出限界や細菌選択性の観点から検証する．また，金ナノ粒子に代わって蛍光性ナノエマルションを利用した“ファージ蛍光ナノプローブ”の開発についても取り掛かっており，引き続き検討する．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
（理由）新型コロナウイルス感染症の拡大防止対策により研究活動が中断するなど，当初予定していた実験計画の一部を実施できなかったこともあり，試薬等の消耗品費が当初予定額を下回った．また，出席を予定していた学会が，すべてオンライン開催となり，研究成果発表旅費を支出する必要がなくなった．
（使用計画）2020年度に実施できなかった実験計画を実行し，金ナノ粒子を作製する無機合成試薬および蛍光色素やナノエマルションを作製する有機合成試薬の購入など消耗品費として利用することを計画している．
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