研究課題
本研究では、高い熱安定性・pH安定性を有する蛋白質ケージ（Scaffold）のもつ直径約8nmの内部空洞に標的蛋白質を閉じ込め、粒子画像抽出が容易なScaffoldごとクライオ電顕単粒子解析法によって立体構造を決定すること、そのために必要な技術基盤を構築することを目的としている。現在までに、モデル分子を用いて発現ベクターの構築から、精製、電顕観察、画像解析までを繰り返し、必要な技術基盤開発を行っているScaffold蛋白質と標的蛋白質の発現量を調節し効率よくScaffold-標的蛋白質複合体を形成させることは可能となった。また、適切な精製タグを用いることでScaffold-標的蛋白質複合体を高純度で精製することに成功した。しかし、構造解析を行うとScaffoldの構造は比較的高分解能で決まるものの、標的蛋白質はScaffold内部で様々な方向を向き本研究のめざす分解能の構造が得られていない。そこで、Scaffoldと標的蛋白質を繋ぐリンカーを種々のαヘリックス形成配列に置換し、標的蛋白質を含まないケージを作成し結晶構造解析にて評価した。ところが、ケージの高い対称性と異なる対称要素を持つため、もしくは期待した硬い構造を形成できないために、いずれの場合もリンカー部分の電子密度を観察できなかった。そこで、Scaffold外側に画像平均化のための目印となる蛋白質を付加することで、Scaffold-標的蛋白質複合体の構造解析を容易にするような方法で解決しようとしている。また、内部空洞の小さい蛋白質ケージを用いた標的蛋白質の固定化も継続して行っている。
4: 遅れている
モデル標的蛋白質としてGFPを用いて、発現系の構築・精製条件検討を行った。その結果、1.画像平均化のための蛋白質タグを付加することで、試料の調整条件が変わったので、構造解析に適した試料調整を行っている。2.今まで用いてきたScaffoldより小さい空洞を持つScaffoldを用いて固定化を試みているが、期待したScaffold-標的蛋白質複合体が得られていない。
内部空洞の小さいScaffoldを用いた系では、標的蛋白質の種類を複数変えて構造解析を試みる。標的蛋白質とScaffoldをつなぐリンカーをAlphaFold2などの構造予測プログラムにより最適化し、再度導入を試みる。
コロナ禍などにより、当初計画より進捗状況が遅れているため、最終年度延長を申請した。試料調製に必要な消耗品ならびに機器修理費に使用予定である。
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FEMS Microbiology Letters
巻: 369 ページ: 1-7
10.1093/femsle/fnac019
Proceedings of the National Academy of Sciences
巻: 118 ページ: 1-7
10.1073/pnas.2016287118
