研究課題
本研究では、高い熱安定性・pH安定性を有する蛋白質ケージ（Scaffold）のもつ直径約8nmの内部空洞に標的蛋白質を閉じ込め、粒子画像抽出が容易なScaffoldごとクライオ電顕単粒子解析法によって立体構造を決定すること、そのために必要な技術基盤を構築することを目的としている。現在までに、モデル分子を用いて発現ベクターの構築から、精製、電顕観察、画像解析までを行い、必要な技術基盤開発を行っている。発現ベクターのコピー数を制限することでScaffold蛋白質と標的蛋白質の発現量を調節し効率よくScaffold-標的蛋白質複合体を形成させることは可能となった。また、精製タグをScaffold蛋白質にも結合してしまうヒスチジンタグからStrepIIタグに変えることでScaffold-標的蛋白質複合体を高純度で精製することに成功した。一方で、構造解析を行うとScaffoldの構造は比較的高分解能で決まるものの、標的蛋白質はScaffold内部で様々な方向を向き本研究のめざす分解能の構造が得られていない。そこで、ケージ内部での標的蛋白質の自由度を下げるために、1）剛直なリンカーを用いる方法。2）ケージの内部空間を狭くする方法。3）Scaffold外側に画像平均化のための目印となる蛋白質を付加する方法・4）既存蛋白質ケージよりも内部空間の狭いケージ蛋白質を用いる方法。およびそれらを組み合わせた方法、を試みたがいずれも標的蛋白質の立体構造決定には至らなかった。
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Analyst
巻: 147 ページ: 4971-4979
10.1039/d2an01051h
Sci Rep.
巻: 12 ページ: 16031
10.1038/s41598-022-19681-9
