| 研究課題/領域番号 |
18K05319
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
麻生 真理子 九州大学, 薬学研究院, 准教授 (30201891)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 蛋白質修飾 / 蛍光 / リジン残基 / 環境応答型蛍光 |
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| 研究実績の概要 |
ターンオン蛍光を伴う部位特異的リジン修飾、クロスリンク形成と蛋白質研究への応用を進めるため、１）環境応答型蛍光基を用いた蛋白質修飾と相互作用検出、２）蛍光を伴うクロスリンク形成反応の開発、３）物性を改良した蛍光分子の開発について検討を行った。１）では、前年度までで大腸菌DNA複製開始蛋白質DnaAのDNA結合領域に結合する配列を持つリジン反応性核酸を用いて、環境応答型蛍光基によるリジン残基修飾を行った。ほぼ修飾反応が終了した反応液に過剰量の未修飾蛋白質を加え反応性核酸を遊離させると反応液の蛍光強度が増加し、修飾蛋白質の蛍光強度は核酸の結合状態で変化する可能性が示唆された。今年度は修飾反応がほぼ終了した反応液にDNaseを加え反応性核酸の分解後に反応液の蛍光を測定した。蛍光強度は増加し、修飾蛋白質の蛍光は核酸が結合した状態に比べ結合しない方が強いという以前の結果を支持する結果を得た。より感度の高い実験を目指し、修飾蛋白質の精製、単離法を検討中である。またLC-MSを用いた修飾蛋白質の構造決定、修飾部位の決定を検討した。
２）では、リジン蛍光修飾分子にクロスリンク形成のためのリンカー部を導入した分子の合成を前年度に引き続き検討し、目的分子合成を完了した。合成した分子はリジン反応性を示し、環境応答型蛍光を示す安定な成績体を与えることが分かった。一方、成績体のリンカー部にエステル結合を持つ場合、エステル結合が徐々に切断された。リンカー部に直接導入予定のDNAと同様の反応性をもつリン酸エステルを導入した分子を合成し、安定性確認後、DNAとの結合を検討する。
３）ではオレフィン部にフェニル基を導入した修飾体の合成、安定性検討、蛍光測定を行った。修飾体は無置換体に比べ蛍光が弱いことが分かった。一方安定性は高かった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
研究代表者、研究協力者ともに新型コロナウイルス感染症拡大防止に配慮し研究活動が制限され、やや遅れているが、研究の完成に向けデータが得られている。
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| 今後の研究の推進方策 |
１）修飾蛋白質の精製、単離において、コバルト樹脂は有効であったが、その後の限外ろ過は蛋白質が少いためか回収率が低かった。微量透析を検討し、蛍光修飾した蛋白質の相互作用を精査する。LC-MSによる修飾蛋白質の構造決定では標的リジン修飾を示唆するデータも得られたが、修飾蛋白質が分析条件下不安定で、データは誤差を含み、精度が低かった。還元などの化学変換により修飾構造の安定化、トリプシン消化を行い、精度の高い構造決定を目指す。
２）リンカー部にDNAを結合した修飾蛋白質のモデルとなる、修飾体のリン酸エステル体を用いた安定性評価後、DNAの結合を検討する。
３）オレフィン部にメチル基、フェニル基を持つ修飾体のリジン修飾反応による生成効率を検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究代表者、研究協力者ともに新型コロナウイルス感染症拡大防止に配慮し研究活動が制限され、当初計画が遅延したため、補助事業期間の延長を申請した。次年度完成に向けて研究計画を行う。
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