| 研究課題/領域番号 |
18K05325
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| 研究機関 | 甲南大学 |
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研究代表者 |
中野 修一 甲南大学, フロンティアサイエンス学部, 教授 (70340908)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | DNA四重鎖構造 / キメラ核酸 / テトラペンチルアンモニウムイオン / 分子クラウディング / RGG配列ペプチド |
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| 研究実績の概要 |
前年度までの研究では、モデルタンパク質として用いたリゾチームと塩基性ポリペプチドがDNAグアニン四重鎖を安定化させ、この作用には非構造部位であるループ部位との静電相互作用が深く関わっていることを明らかにした。そこで今年度は、グアニン四重鎖結合タンパク質に見られるRGG（アルギニン-グリシン-グリシン）モチーフの影響について検討した。蛍光標識化DNAを用いた融解温度測定を様々な条件で行うことで、RGG配列ペプチドがグアニン四重鎖のループ部位に結合しやすいことを明らかにした。また、デキストランを用いて構築した分子クラウディング環境におけるDNA四重鎖の安定化効果は、リゾチーム（塩基性タンパク質）では大きく向上したが、RGG配列ペプチド（塩基性ペプチド）ではリゾチームほどの向上は見られなかった。この結果から、DNAと塩基性タンパク質の相互作用には排除体積効果が大きく影響することが示唆された。
DNA非構造部位へのカチオン性分子の結合性を明らかするために、RNA-DNAキメラ核酸のアルカリ加水分解測定による評価も試みた。マグネシウムイオンによるリボヌクレオチド部位の切断速度解析を行い、テトラペンチルアンモニウムイオン（嵩高い1価カチオン）がマグネシウムイオンと一本鎖核酸の結合を阻害することを見出した。非構造部位を含むインターナルループ構造とバルジループ構造に対して同様の検討を行ったところ、テトラペンチルアンモニウムイオンはDNAループ構造のループ部位にも結合することが示された。この結果は、核酸構造の安定性データに基づいて推測された結合機構（大きなサイズのアルキルアンモニウムイオンが核酸の非構造部位と優先的に結合すること）の妥当性を示している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
今年度のオリゴペプチドを用いた検討によって、塩基性タンパク質によるグアニン四重鎖構造の安定化にはカチオン性分子と核酸の非構造部位の間の静電相互作用が深く関わっていることを示した。さらに、エチレングリコール鎖で置換したループを有するグアニン四重鎖と、RNA-DNAキメラ核酸のアルカリ加水分解反応を利用した評価にも取り組み、DNAの非構造部位に嵩高いカチオン性分子が結合することを明らかにした。今年度は、DNAのi-motif構造（シトシンの連続配列が形成する四重鎖）とRNAのインターナルループ構造を対象とした検討も開始した。ループ構造に与える影響はRNAとDNAでは大きな違いは見られないが、i-motif構造に与える影響がグアニン四重鎖構造とは異なるという予備的な結果が得られている。
分子クラウディング環境における検討からは、グアニン四重鎖と塩基性タンパク質の結合には排除体積効果が大きく影響し、分子クラウディング環境では非特異的な静電相互作用が強められることを明らかにした。これらの研究により、細胞内部（分子クラウディング環境、塩基性タンパク質・ペプチドが存在する環境）は様々な種類のグアニン四重鎖構造が安定に存在できる環境であることが推測される。感染症対策のため一部の研究に進捗の遅れがあるものの、核酸の非標準構造形成における非構造部位の新たな役割が明らかになりつつある。
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| 今後の研究の推進方策 |
DNAグアニン四重鎖において示された非構造部位の役割の一般性を探るために、新たな核酸構造を対象とした研究を進める。とくに、i-motif構造（シトシンの連続配列が形成する四重鎖）に対する影響をグアニン四重鎖の結果と比較することで、不安定な四重鎖構造の形成に与える嵩高いカチオン性分子の影響を調べる。また、これまであまり検討ができていないRNA非構造部位の役割の解明も進める。RNAの二次構造（インターナルループ構造など）とともに、ハンマーヘッドリボザイムの触媒活性構造（分岐構造）やtRNA（シュードノット構造）のような高次構造も調べる予定である。さらに、カチオン性分子との結合によって引き起こされる非構造部位の構造変化の検討にも取り組む。
これまで行ってきた研究のさらなる深化も試みる。カチオン性分子として、塩基性タンパク質・ペプチド・ポリアミンの影響を系統的に調べるとともに、カチオン性分子の立体障害をRNA-DNAキメラ核酸の加水分解速度解析によって評価する。また、分子クラウディング環境における検討も進め、核酸とタンパク質の間の非特異的な静電相互作用を強化するメカニズムの解明を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
感染症対策により研究活動が大幅に制限されたため、今年度は計画通りに研究を進めることができなかった。このため、消耗品の購入に充てる予定であった予算（RNAオリゴヌクレオチドの購入費等）に残余が生じ、計画していた学会出張費も不要となった。次年度は、引き続き大学における感染症対策に基づいて、研究に必要な消耗品（オリゴペプチド、分子クラウディング剤等）の購入や研究成果の公表に必要な経費として予算を執行する。
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