| 研究課題/領域番号 |
18K05325
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| 研究機関 | 甲南大学 |
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研究代表者 |
中野 修一 甲南大学, フロンティアサイエンス学部, 教授 (70340908)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | DNA四重鎖 / ハンマーヘッドリボザイム / キメラ核酸 / テトラペンチルアンモニウムイオン / 分子クラウディング / グアニン四重鎖結合タンパク質 |
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| 研究実績の概要 |
細胞内部の分子環境が核酸の非構造部位に与える影響を明らかにするために、今年度は新たな核酸構造を対象とした調査を行った。RNA二重鎖のループ構造を対象とした検討では、塩基性タンパク質がループ構造に与える影響はRNAとDNAでは大きな違いは見られなかったが、高濃度タンパク質がRNA鎖の分解を引き起こすことが確認され、定量的評価の難しさが浮き彫りになった。一方で、嵩高い有機カチオンであるテトラペンチルアンモニウムイオンはRNA分解を引き起こさず、RNA二重鎖のループ構造（インターナルループ構造）とハンマーヘッドリボザイムの触媒活性構造（3分岐構造）の安定性に与える影響を評価できることがわかった。また、DNAシトシン四重鎖（i-motif構造）を対象とした検討では、塩基性タンパク質であるリゾチームは安定化をもたらす一方で生体ポリアミンは不安定化をもたらし、カチオン性物質の影響が二重鎖構造やグアニン四重鎖とは異なることを見出した。
DNA二重鎖とグアニン四重鎖に対して、新たにシトクロームcとヒストンを用いた検討を行った。これらの塩基性タンパク質は、以前に用いたリゾチームと類似の効果を示し、DNAのループ部位に結合して非標準構造を安定化させた。さらに、グアニン四重鎖結合タンパク質に見られるDNA結合部位のアミノ酸配列を有する塩基性ペプチドを用いることによって、静電相互作用の重要性を示すデータを得ることができた。
RNA-DNAキメラ核酸のアルカリ加水分解速度の測定結果に基づいて、カチオン性物質との間の弱い相互作用を評価する試みも行なった。前年度に引き続いてアルキルアンモニウムイオンの結合性を調べるとともに、今年度は異なるタイプの有機カチオンについての検討も行った。この取り組みにより、様々な有機カチオンとの間の結合性を比較できるデータが得られつつある。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
前年度までに、リゾチーム（塩基性タンパク質）やアルキルアンモニウムイオン（有機カチオン）は高濃度条件において核酸の非構造部位に結合することを明らかにしてきた。さらに、その結合性は分子クラウディング環境下で向上することも見出した。今年度は、新たな核酸構造（RNA二重鎖、DNAシトシン四重鎖）を対象とした検討と、新たなタンパク質（ヘムタンパク質、ヒストン）とオリゴペプチド（グアニン四重鎖結合性タンパク質の核酸結合配列）を用いた調査を進め、核酸とタンパク質の間に生じる弱い相互作用の一般性について調べた。様々なタイプの核酸構造において、ループ部位をもつ構造体は様々な種類のカチオン性物質によって安定化され、その効果の大きさは非構造部位のヌクレオチド長によって異なることを示すことができた。興味深いことに、カチオン性物質の核酸結合性には、核酸の非塩基対部位の構造柔軟性とカチオン性物質の構造柔軟性がともに影響することを示唆するデータが得られている。このように、核酸の非構造部位の新たな役割が明らかになり、細胞内の分子環境においてカチオン性の生体化合物は核酸の非標準構造形成に大きな影響を与えると言えそうである。また、シトシン四重鎖に与える影響が、二重鎖やグアニン四重鎖構造とは異なるという結果が得られている。カチオン性物質の影響について一般性が明らかになりつつある一方で、このような例外的な作用も見出されたことから、その相互作用メカニズムに興味が持たれる。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでに行ってきた研究によって、様々な種類のカチオン性物質（金属イオン、生体ポリアミン、テトラアルキルアンモニウムイオン、塩基性タンパク質、オリゴペプチドなど）がDNAとRNAの非構造構造の形成に与える影響が解明されつつある。研究の最終年度となる次年度は、核酸とタンパク質の間の非特異的な弱い静電相互作用の一般性の検証を進めるとともに、カチオン性物質による核酸の構造遷移と非構造部位の誘導適合の評価にも力を入れる。弱い静電相互作用の検証では、引き続き様々なタイプの核酸構造を対象とした比較検討を行い、核酸とカチオン性物質の構造柔軟性に着目した解析を試みる。さらに、RNAまたはキメラ核酸の加水分解速度の評価系を利用した検討も進め、様々な種類の有機カチオンとの結合性を比較することで、核酸とタンパク質の間の相互作用機構の解明を試みる。核酸の構造遷移については、非構造部位に結合する有機カチオンを用いて構造遷移を実現する方法を検討する。以上の取り組みによって、細胞内の分子環境がDNAとRNAの非構造部位の形成に与える効果を明らかにし、細胞内物質との間の弱い相互作用が核酸の非標準構造の形成に与える影響を理解することを目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度はほぼ計画通りに研究が進んだが、感染症対策に伴う研究活動の制限による研究の遅れの影響が続いている。このため、一部の研究に進捗の遅れがあり、消耗品の購入に充てる予定であった予算に残余が生じている。また、計画していた学会出張費も不要となっている。次年度は主に、研究遂行に必要な消耗品（DNA、RNA、オリゴペプチド、分子クラウディング剤など）の購入と研究成果を公表するための経費として予算を執行する予定である。
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