膜タンパク質の機能を制御する中分子アプタマーの創出とその構造学的基盤の解明

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 18K05334
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 野村 紀通 京都大学, 医学研究科, 助教 (10314246)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: 膜タンパク質 / 創薬ターゲット / 中分子ペプチド / ファージディスプレイ / X線結晶構造解析

研究実績の概要

がん、高血圧、慢性炎症など種々の疾病に対する医薬品の分子標的の多くは膜タンパク質である。その構造解析の難度は依然として高いため、現時点で構造ベースの創薬研究の進展は限定的である。これまで研究代表者らは膜タンパク質に抗体フラグメントを結合させて結晶化を促進するという独自技術を開発し、X線結晶構造解析を推進してきた。本研究では、膜タンパク質の機能を制御する中分子アプタマーの創出とその構造学的検証に有用な新しい方法論を確立することを目指している。
本年度は、大環状ペプチドではなく、立体的束縛を有する安定なペプチド分子骨格 (50-90残基) を基盤として複数の末端ループの配列と長さを多様化した合成ライブラリーを作製し、高い親和性と特異性を兼ね備えたバインダーの探索を試みた。具体的には分子内に多数のジスルフィド結合が架橋され強い立体的束縛のある安定な中分子ペプチド骨格であるICK (inhibitor cysteine knot) フォールドをベースとして、その末端ループの配列と長さを多様化した中分子母集団を人工合成し、ファージディスプレイ系ライブラリーを作製した。免疫チェックポイント受容体PD-1、
炎症性サイトカインTNFα等の複数のモデル標的分子を用いて、特異的に認識し結合するファージ集団を4-12サイクル程度の選抜を経て、増幅・濃縮した。選抜過程でのファージ集団の優占度の遷移をシーケンス解析にて評価した。以上の解析から解離定数が数μM程度の中分子バインダーが取得可能であることを示した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

立体的束縛を有する安定なペプチド分子骨格 (50-90残基) を基盤として複数の末端ループの配列と長さを多様化した合成ライブラリーを実際に作製して、異なる複数の創薬ターゲットに対して中分子バインダーが取得可能であるというフィージビリティーを検証することができたため、初年度の目標は概ね達成できていると自己評価した。

今後の研究の推進方策

大きな細胞外ドメインをもつ一回膜貫通受容体膜タンパク質(PD-1)や可溶性サイトカイン(TNFα)など限られた標的のみならず、今後はGタンパク質共役受容体 (GPCR)、イオンチャネル、膜輸送体など比較的小さな細胞外ドメインしか持たない多数回膜貫通型の内在性膜タンパク質をも標的とした中分子バインダー取得のための技術開発を進めてゆきたい。

次年度使用額が生じた理由

当初計画では，本年度にX線結晶構造解析の回折データ測定のためSPring-8への出張を見込んでいたが、創薬ターゲットタンパク質ー中分子バインダー複合体の結晶がまだ生成していないことから、その出張計画を中止した。そのため出張経費を使用しなかったために次年度使用額が生じた。当該経費は、次年度以降に当初計画通りのSPring-8出張費として使用する計画である。

研究成果

• [国際共同研究] Martin-Luther Universitat(ドイツ)
  • 国名: ドイツ
  • 外国機関名: Martin-Luther Universitat
• [雑誌論文] Structures of the 5-HT2A receptor in complex with the antipsychotics risperidone and zotepine (2019)
  • 著者名/発表者名: Terakado-Kimura K, Asada H, Inoue A, Kadji FMN, Im D, Mori C, Arakawa T, Hirata K, Nomura Y, Nomura N, Aoki J, Iwata S, Shimamura T
  • 雑誌名: Nature Structural and Molecular Biology 巻: 26 ページ: 121-128
  • DOI: 10.1038/s41594-018-0180-z
  • 査読あり
• [雑誌論文] Ligand binding to human prostaglandin E receptor EP4 at the lipid-bilayer interface (2019)
  • 著者名/発表者名: Toyoda Y, Morimoto K, Suno R, et al.
  • 雑誌名: Nature Chemical Biology 巻: 15 ページ: 18-26
  • DOI: 10.1038/s41589-018-0131-3
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structural basis for tumor necrosis factor blockade with the therapeutic antibody golimumab (2018)
  • 著者名/発表者名: Ono M, Horita S, Sato Y, Nomura Y, Iwata S, Nomura N
  • 雑誌名: Protein Science 巻: 27 ページ: 1038-1046
  • DOI: https://doi.org/10.1002/pro.3407
  • 査読あり
• [雑誌論文] Crystal structure of the human angiotensin II type 2 receptor bound to an angiotensin II analog (2018)
  • 著者名/発表者名: Asada H, Horita S, Hirata K, Shiroishi M, Shiimura Y, Iwanari H, Hamakubo T, Shimamura T, Nomura N, Kusano-Arai O, Uemura T, Suno C, Kobayashi T, Iwata S.
  • 雑誌名: Nature Structural and Molecular Biology 巻: 25 ページ: 570-576
  • DOI: 10.1038/s41594-018-0079-8
  • 査読あり
• [雑誌論文] Outward open conformation of a Major Facilitator Superfamily multidrug/H+ antiporter provides insights into switching mechanism (2018)
  • 著者名/発表者名: Nagarathinam K, Nakada-Nakura Y, Parthier C, Terada T, Juge N, Jaenecke F, Liu K, Hotta Y, Miyaji T, Omote H, Iwata S, Nomura N, Stubbs M, Tanabe M
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 9 ページ: 4005
  • DOI: 10.1038/s41467-018-06306-x
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [図書] Methods Molecular Biology, Vol. 1700, Yamaguchi, A. and Nishino, K. (Eds.) “Bacterial Multidrug Exporters” (2018)
  • 著者名/発表者名: Jaenecke F., Nakada-Nakura, Y., Nagarathinam, K., Ogasawara, S., Liu, K., Hotta, Y., Iwata, S., Nomura, N., Tanabe, M
  • 総ページ数: 355
  • 出版者: Springer
  • ISBN: 978-1-4939-7452-8
• [備考] 薬剤耐性の原因「薬剤汲み出しタンパク質」の排出メカニズムを解明
  • URL: http://www.kyoto-u.ac.jp/ja/research/research_results/2018/181001_2.html
• [備考] 分子の立体構造から血圧調節の仕組みを原子レベルで解明 －高血圧症の新しい治療法の開発へ－
  • URL: http://www.kyoto-u.ac.jp/ja/research/research_results/2018/180702_2.html
• [備考] プロスタグランジン受容体の立体構造を世界初解明
  • URL: http://www.kyoto-u.ac.jp/ja/research/research_results/2018/181204_2.html
• [備考] 統合失調症やパーキンソン病の治療薬の標的の構造解明 －副作用を抑えた薬の合理的な探索・設計が可能に－
  • URL: http://www.kyoto-u.ac.jp/ja/research/research_results/2018/190205_1.html