膜タンパク質の機能を制御する中分子アプタマーの創出とその構造学的基盤の解明

2020 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 18K05334
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 野村 紀通 京都大学, 医学研究科, 准教授 (10314246)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: 膜タンパク質 / 中分子 / 抗体 / 創薬 / X線結晶構造解析 / クライオ電子顕微鏡単粒子解析

研究実績の概要

がん、高血圧、慢性炎症など種々の疾病に対する医薬品の分子標的の多くは膜タンパク質である。その構造解析の難度は依然として高いため、現時点で構造べースの創薬研究の進展は限定的である。これまで申請者は膜タンパク質に抗体フラグメントを結合させて結晶化を促進するという独自技術を開発し、X線結晶構造解析を推進してきた。本研究では、膜タンパク質の機能を制御する中分子アプタマーの創出とその構造学的検証に有用な新しい方法論の確立を目指した。
立体的束縛を有する安定なペプチド分子骨格 (50-90残基) を基盤として複数の末端ループの配列と長さを多様化した合成ライブラリーを作製した。 具体的には分子内に多数のジスルフィド結合が架橋され強い立体的束縛のある安定な中分子ペプチド骨格をベースとして、その末端ループの配列と長さを多様化した中分子母集団を人工合成し、ファージディスプレイ系ライブラリーを作製した。病原ウイルス感染のエントリーレセプターとして機能するヒト膜タンパク質Aやがんの転移能獲得・悪性化進展に関与するヒト膜タンパク質B等の複数の創薬標的膜タンパク質について，(1) 界面活性剤ミセルに覆われた状態の精製試料，(2)脂質ナノディスクに再構成した状態の試料等を作り、さらにパニングにおいて独自技術を導入することによって、これらの膜タンパク質ターゲットに対して特異的に認識し結合するファージ集団を4-12サイクル程度の選抜を経て取得した。
膜タンパク質/中分子ペプチド複合体を精製し、それを抗原として用いて結晶化促進ツールとしての構造認識抗体を作製した。Fab抗体断片の添加により、 膜タンパク質/中分子ペプチド/Fabの三者複合体の精製品を調製し、クライオ電子顕微鏡単粒子解析を進めた。

研究成果

• [国際共同研究] Fudan University(中国)
  • 国名: 中国
  • 外国機関名: Fudan University
• [国際共同研究] University of Sydney/Centenary Institute(オーストリア)
  • 国名: オーストリア
  • 外国機関名: University of Sydney/Centenary Institute
• [雑誌論文] Cryo-EM Structure of the Prostaglandin E Receptor EP4 Coupled to G Protein (2021)
  • 著者名/発表者名: Nojima Shingo、Fujita Yoko、Kimura Kanako Terakado、Nomura Norimichi、Suno Ryoji、Morimoto Kazushi、Yamamoto Masaki、Noda Takeshi、Iwata So、Shigematsu Hideki、Kobayashi Takuya
  • 雑誌名: Structure 巻: 29 ページ: 252～260.e6
  • DOI: 10.1016/j.str.2020.11.007
  • 査読あり
• [雑誌論文] The structure of MgtE in the absence of magnesium provides new insights into channel gating (2021)
  • 著者名/発表者名: 7.Jin F, Sun M, Fujii T, Yamada Y, Wang J, Maturana AD, Wada M, Su S, Ma J, Takeda H, Kusakizako T, Tomita A, Nakada-Nakura Y, Liu K, Uemura T, Nomura Y, Nomura N, Ito K, Nureki O, Namba K, Iwata S, Yu Y, Hattori M.
  • 雑誌名: PLoS Biol. 巻: 19 ページ: e3001231
  • DOI: 10.1371/journal.pbio.3001231
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Structural insights into tetraspanin CD9 function (2020)
  • 著者名/発表者名: Umeda Rie、Satouh Yuhkoh、Takemoto Mizuki、Nakada-Nakura Yoshiko、Liu Kehong、Yokoyama Takeshi、Shirouzu Mikako、Iwata So、Nomura Norimichi、Sato Ken、Ikawa Masahito、Nishizawa Tomohiro、Nureki Osamu
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 11 ページ: 1606
  • DOI: 10.1038/s41467-020-15459-7
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Atg9 is a lipid scramblase that mediates autophagosomal membrane expansion (2020)
  • 著者名/発表者名: Matoba Kazuaki、Kotani Tetsuya、Tsutsumi Akihisa、Tsuji Takuma、Mori Takaharu、Noshiro Daisuke、Sugita Yuji、Nomura Norimichi、Iwata So、Ohsumi Yoshinori、Fujimoto Toyoshi、Nakatogawa Hitoshi、Kikkawa Masahide、Noda Nobuo N.
  • 雑誌名: Nature Structural & Molecular Biology 巻: 27 ページ: 1185～1193
  • DOI: 10.1038/s41594-020-00518-w
  • 査読あり
• [雑誌論文] Isolation and thermal stabilization of mouse ferroportin (2020)
  • 著者名/発表者名: Deshpande Chandrika N.、Azucenas Corbin R.、Qiao Bo、Nomura Norimichi、Xin Vicky、Font Josep、Iwata So、Ganz Tomas、Nemeth Elizabeta、Mackenzie Bryan、Jormakka Mika
  • 雑誌名: FEBS Open Bio 巻: 11 ページ: 26～34
  • DOI: 10.1002/2211-5463.13039
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Structure of the dopamine D2 receptor in complex with the antipsychotic drug spiperone (2020)
  • 著者名/発表者名: Im Dohyun、Inoue Asuka、Fujiwara Takaaki、Nakane Takanori、Yamanaka Yasuaki、Uemura Tomoko、Mori Chihiro、Shiimura Yuki、Kimura Kanako Terakado、Asada Hidetsugu、Nomura Norimichi、Tanaka Tomoyuki、Yamashita Ayumi、Nango Eriko、Tono Kensuke、Kadji Francois Marie Ngako、Aoki Junken、Iwata So、Shimamura Tatsuro
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 11 ページ: 6442
  • DOI: 10.1038/s41467-020-20221-0
  • 査読あり / オープンアクセス
• [図書] “The Intervening Removable Affinity Tag (iRAT) System for the Production of Recombinant Antibody Fragments” in Methods Mol Biol. (2021)
  • 著者名/発表者名: *Nomura N, Nomura Y, Sato Y and *Iwata S.
  • 総ページ数: 340
  • 出版者: Humana Press