2018 年度実施状況報告書

新奇糖転移酵素によるS-結合型糖鎖修飾の構造基盤の解明

研究課題

研究課題/領域番号	18K05340
研究機関	学習院大学
研究代表者	中村顕学習院大学, 理学部, 助教 (40432356)
研究期間 (年度)	2018-04-01 – 2021-03-31
キーワード	糖転移酵素 / X線結晶構造解析 / 抗生物質
研究実績の概要	本研究では、ポリペプチド中のシステイン残基側鎖のチオール基に糖を付加する新奇S結合型糖転移酵素ThuSについて、構造生物学的研究を通じて、化学的・生物学的安定性が高いS結合型糖鎖修飾を触媒する酵素の反応機構の詳細な解明を目指している。平成３０年度は、試料調製の条件検討を行い、活性測定系の構築と構造解析を目指した実験を行った。 GST-タンパク質を融合させた状態およびHis-タグを付加させた状態でのThuSタンパク質を大腸菌で大量発現させるための条件を検討し、手法を確立した。得られた大腸菌は超音波破砕し、アフィニティークロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーによって、95%以上の純度でThuSタンパク質を精製することに成功した。この精製標品を用いて、結晶化条件のスクリーニングと円偏光二色性スペクトル測定、予備的なX線小角散乱測定を行った。また、調製したThuSタンパク質の糖転移活性を確認するためのアッセイ系も構築した。結晶化条件スクリーニングの結果、良質な単結晶が得られた。放射光施設Photon FactoryでのX線を用いた回折実験の結果、最高で2.7 Å分解能の回折強度データを取得することができた。位相決定のため、セレノメチオニン置換体および重原子誘導体を調製し、これらの結晶の回折強度データも収集した。現在解析を進めている。円偏光二色性スペクトル測定の結果、ThuSはαヘリックスに富んだ構造を持つことが明らかとなった。また、X線小角散乱測定からはThuSが複数のドメインで構成されていることが示唆された。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由当初の計画通り、解析試料の調製を進め、構造学的解析を実施している。結晶化に成功し、立体構造決定が可能なX線回折強度データを収集しており、位相決定を進めている。また、ThuSが触媒する、ポリペプチド中のシステイン残基に対する糖転移反応を検出するための測定系も構築した。これにより、変異体解析等を推し進めることが可能となった。
今後の研究の推進方策	ThuSの結晶構造解析を早急に進めると同時に、より高分解能での立体構造解析を目指して、結晶化条件等の改善をはかる。マルチドメイン構造をとることが予想されたため、基質結合時の構造変化の有無をThuSと基質ポリペプチドとの複合体の結晶構造解析ならびに小角散乱測定によって検証する。また、構築した活性測定系を用いた変異体解析に取り組み、S結合型糖転移反応の分子メカニズム解明を目指す。
次年度使用額が生じた理由	平成３０年度の計画予算内において、本研究遂行のための物品購入や旅費等に支出した結果、端数が生じたため、これを平成３１年度請求分の助成金とともに使用する。当初の計画通り、解析対象のタンパク質試料調製ならびに変異体タンパク質等を用いた活性測定を行うために必要な試薬・物品の購入、構造解析等に必要な高速計算機関連物品の購入、成果発表等に必要な旅費等の経費へ支出する予定である。