| 研究課題/領域番号 |
18K05345
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
石渡 明弘 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 専任研究員 (70342748)
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| 研究分担者 |
張 恵平 国立研究開発法人理化学研究所, 放射光科学研究センター, 研究員 (10462706)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 合成糖鎖 / 酵素 / 糖鎖-タンパク質複合体 / NMR / 相互作用解析 |
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| 研究実績の概要 |
昨年度までに、アラビナン分解酵素の基質オリゴアラビノフラノシド(Araf)誘導体の調製、酵素の基質特異性、切断機構に関する知見を得た。結合位置、活性中心を含むアラビナン結合サイトの解明のため、糖側の結合情報を得るためのフローブ合成を行った。エンド型加水分解酵素による主鎖内部、エキソ型による主非還元末端側α-1,5 結合の切断されないプローブとしてα-チオグリコシドを調整した。
エンド型加水分解酵素のビフィズス菌由来類縁体がフルクトシド (Fruf) 分解酵素であると示唆されたが、天然基質二糖の縮合を確認した。PNP α-D-Frufを基質とし活性測定での基質の不安定性が判明したが、類似構造のPNP α-D-Araf基質が利用可能で、チオグリコシドの阻害活性を確認した。さらに、基質を用いた反応機構解析により、酵素分解で最初に生成する遊離の糖残基の構造解析により、二回反転型の保持機構と確定できた。また、化学合成したPNP β-L-Araf基質を用いたビフィズス菌由来のAraf分解酵素の機構解析では、システイン求核残基による新規機構を構造生物的に証明するに至った。同様にアラビアガム糖鎖分解を担う分解酵素の基質及び分解生成物の合成及びNMRによる解析にて新規ガラクトシル-Araf加水分解酵素を見いだした。
モデル系にて検討したSTD実験系にて、既知のエンド型酵素と調製した糖受容体基質など種々相互作用検討での構造情報や酵素濃度などに関する知見を得たが、NMR測定用競合的阻害剤のチオグリコシドのエキソ型酵素に対する阻害活性が、類縁体酵素と比べ低下していることが見出され、オリゴ糖構造認識を示唆する結果となった。鎖状オリゴArafを準備しエンド酵素の検証の際に考慮する計画である。また、各種酵素阻害剤としての海産及び植物由来新規天然有機化合物の 機構解明へ向けた構造解析も併せて進めた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
初年度の基質調製、反応機構解析、次年度の、阻害剤化合物の調整検討と並行して、モデル系での糖鎖―タンパク質相互作用解析のNNMR測定条件の設定検討に引き続き、年間を通した自粛状況もあり、進展には困難を極めた。一方で、同様な手法にて、化学的手法や、詳細なNMR解析により新規ホモログが分解するフルクトース誘導体の構造解析、同様にビフィズス菌関連の新規アラビノシド加水分解酵素群の開拓やメカニズム解析へも展開・応用できた。次年度も自自粛が続くと予想されるが、粛々と解析を進める、。これまでの成果の報告は、延長した次年度にすすめる。
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| 今後の研究の推進方策 |
本申請では、『合成糖鎖－タンパク質複合体のNMR手法による酵素基質切断部位解析』をテーマに取り上げ、ミコバクテリアの細胞壁複合糖質の合成化学と高磁場NMRの利用で特に糖鎖リガンド側のピーク分解能を最大限に上げることでこれまでにない構造解析を達成しようと計画している。分析・測定に関しては、ヒト由来糖タンパク質糖鎖フラグメントと関連タンパク質の相互作用で検討し確立したSTD実験系を用いて、研究代表者が合成を達成している糖誘導体と連携研究者より調達予定の実際の結核菌endo型酵素およびその変異体を用いた、合成糖鎖基質群との相互作用解析を行い、切断位置特異性についての構造化学的知見を得る計画である。アラビナンは糖残基が単一なオリゴ糖であるので、構造解析はより困難になると予想しているが、今後は解析用に分岐構造などを導入したプローブの利用などにする。分子モモデリングでの結合サイトの検証、基質と酵素反応生成物との安定性の差の検証を進めたいと考えている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度は、年間を通して思うように研究が進められず、また、国際学会の開催などが延期されたことがひとつの大きな理由である。本年度の成果も国際学会などでの報告を行う計画であり、その参加費用として使用したいと、考えている。また本年度はNMRによる構造解析を、研究組織変更に伴い代表者が進める予定で考えており、そのための測定の受益者負担費として使用したいと考えている。
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