| 研究課題/領域番号 |
18K05347
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
桑原 正靖 日本大学, 文理学部, 教授 (40334130)
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| 研究分担者 |
河島 尚志 東京医科大学, 医学部, 主任教授 (70224772)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | Point of Care Testing |
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| 研究実績の概要 |
インフルエンザウイルス等のＲＮＡウイルスは、突然変異を引き起こしやすく頻繁に連続抗原変異を生じる。それが迅速な診断や適切な予防を妨げ、流行が繰り返される主因となっている。そこで、本研究では、新型ウイルスの出現やその年の流行型を正確かつ初期に察知・診断する方法論を確立することを目的として、まず、独自開発した遺伝子等温簡便検出法であるＳＡＴＩＣ（ｓｉｇｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｅｒｎａｒｙ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）法の反応系に用いる試薬成分の最適化を検討した。陽性反応で生成するグアニン四重鎖（Ｇ４）を蛍光染色するためにチオフラビンＴ（ＴｈＴ）誘導体を用いるが、これまでに開発した誘導体ＴｈＴ－ＨＥの他に、幾種かの誘導体を新たに作製した。その結果、Ｎ３位にアミノ基を介してポリエチレングリコールリンカーを付加したものが、パラレル型Ｇ４に対して、良好な特異性と発光応答を示すことが分かった。次いで、最近接塩基（ｎｅａｒｅｓｔ－ｎｅｉｇｈｂｏｒ）法に基づき、環状ＤＮＡ鋳型鎖やプライマー鎖の配列の最適化を検討した。その結果、環状鋳型鎖にハイブリダイゼーションするプライマー３’側数残基の部分について、変異検出に最も最適な配列を得た。また、磁気ビーズ等を用いた高感度検出法の適用を検討したところ、数十コピーのウイルス遺伝子を特異的に検出できることを確認した。現時点でおよそ３０分以内で計測できるようになっている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
環状ＤＮＡ鋳型鎖やプライマー鎖等の配列の改良や蛍光試薬であるチオフラビン誘導体の化学構造の改良、さらには、それら検出試薬の濃度やその比率、バッファー組成等の条件などの最適化により、実際に臨床で使用するレベルの検出感度がされた点等。特に、配列の改良において、点変異の有無で、明瞭な差異をもたらすことが可能なΔG(当該二重鎖部分のギブスエネルギー)の範囲を特定できた点。
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| 今後の研究の推進方策 |
研究の進捗状況が概ね順調であることから、当初計画に沿って研究を実施していく。次年度は、増幅効率の向上による反応時間の短縮や変異を標的とした簡易検出系の構築等に取り組む。ウイルス遺伝子の変異の違いで少なくとも10倍以上の出力差をもたらす特異的検出系をを目指す。さらには、培養細胞(MDCK細胞等)を用いたin vitroウイルス感染系の構築も併せて検討する。
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