• 研究課題をさがす
  • 研究者をさがす
  • KAKENの使い方
  1. 課題ページに戻る

2019 年度 実施状況報告書

ペプチドタグ間の化学反応に基づく相互作用検出を利用した薬剤結合蛋白質の網羅的探索

研究課題

研究課題/領域番号 18K05348
研究機関群馬大学

研究代表者

高橋 剛  群馬大学, 大学院理工学府, 准教授 (90345380)

研究期間 (年度) 2018-04-01 – 2021-03-31
キーワードオフターゲットタンパク質 / ドラッグ・リポジショニング / βラクタマーゼ / NanoLucルシフェラーゼ
研究実績の概要

薬剤が作用する本来の標的以外のオフターゲット分子を見つけ出すことは、副作用の理解のみならず、異なる作用機序を示す薬剤としての利用(ドラッグ・リポジショニング)も期待できる。申請者はこれまでに、化合物-タンパク質間相互作用を酵素活性を指標として読み出す方法(Interaction-Dependent Native Chemical Ligation and Enzyme Reconstitution; IDNCL-ER)を開発してきている。本研究では、このIDNCL-ER法や、タンパク質トランススプライシング(PTS)を利用した相互作用検出系を用いて、薬剤や薬剤候補化合物が相互作用するタンパク質を網羅的に探索する方法の開発を目的とした。
令和元年度は主に、PTS法を利用して、βラクタマーゼ活性を指標として薬剤-タンパク質間相互作用を検出する系の開発にも取り組んだ。βラクタマーゼは、βラクタム系抗生物質を分解する酵素であり、これを検出酵素として用いることができれば、抗生物質耐性を指標としてオフターゲットタンパク質の探索ができるものと期待した。実際に、当研究室で開発した分割インテインDnaE変異体を用いて、ペプチド-タンパク質間の相互作用に依存してβラクタマーゼ活性が生成する系の開発を試みた。 モデル系として、リン酸化ペプチドとリン酸化ペプチドと相互作用するSrc SH2タンパク質を用い、ペプチド-タンパク質間の相互作用に依存したβラクタマーゼ活性の生成について検討した。リン酸化ペプチドの濃度が増大すると、酵素活性が増大したことから、相互作用に依存してインテイン断片が近づき、それにより、PTS反応が進行することで、活性型のβラクタマーゼが生成することが分かった。
現在、大腸菌やグラム陽性細菌を用いた系で、薬剤-タンパク質間の相互作用に依存した活性型βラクタマーゼの産生および、それによる抗生物質耐性の獲得について検討している。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

昨年は予定通り、βラクタマーゼ活性を指標とした相互作用検出系の構築を行うことができた。以上から、研究はおおむね順調に進展しているといえる。

今後の研究の推進方策

本年度は、引き続き、βラクタマーゼ活性を指標にした相互作用検出系について検討を行い、寒天培地上でのコロニーの選別を利用して相互作用を検出する実験系の構築を試みる。ここでは、大腸菌を用いたペリプラズム発現系や、ファージを利用した方法、グラム陽性菌を利用した分泌発現系などを利用して、薬剤と発現タンパク質間の相互作用をin vivoで検出する系の開発を試みる。
また、抗生物質として利用されているカナマイシン耐性遺伝子産物であるアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼを検出酵素とした相互作用検出系の開発にも着手する。
これらの系を利用して、アンピシリンやカナマイシンによる薬剤-タンパク質間相互作用のスクリーニングが可能な系を確立する。実際に上タンパク質ライブラリ発現系を用いて、アンピシリン耐性やカナマイシン耐性を利用したオフターゲットタンパク質の探索に取り組む予定である。

次年度使用額が生じた理由

次年度の使用予定額が申請時よりも大きく減少したこと、消費税の影響があることを鑑み、節約につとめざるを得ず、何とか次年度に繰り越すことができた。

  • 研究成果

    (6件)

すべて 2020 2019

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件) 学会発表 (5件)

  • [雑誌論文] Generation of Active Protease Depending on Peptide-Protein Interactions Using Interaction-Dependent Native Chemical Ligation and Protein Trans-Splicing2019

    • 著者名/発表者名
      Tsuyoshi Takahashi
    • 雑誌名

      Bull. Chem. Soc. Jpn.

      巻: 92 ページ: 1767-1772

    • DOI

      doi:10.1246/bcsj.20190159

    • 査読あり
  • [学会発表] リガンド-タンパク質間相互作用に依存したタンパク質スプライシングを利 用した活性型酵素生成系の構築2020

    • 著者名/発表者名
      萩原弘顕、高橋剛
    • 学会等名
      日本化学会第100春季年会
  • [学会発表] ペプチドタグ間のライゲーションとNanoLucレポーターを用いた合成化合物-タンパク質相互作用の細胞内検出2020

    • 著者名/発表者名
      高橋剛、萩原弘顕
    • 学会等名
      日本化学会第100春季年会
  • [学会発表] ペプチドタグの連結とNanoLuc 再構成を利用したアトルバスタチンータ ンパク質間相互作用の検出2019

    • 著者名/発表者名
      萩原弘顕、藤岡芽生子、高橋剛
    • 学会等名
      第13回バイオ関連化学シンポジウム
  • [学会発表] 人工分割インテインの相補的反応を用いたNanoLucルシフェラーゼ生成システムの構築2019

    • 著者名/発表者名
      高橋剛
    • 学会等名
      第13回バイオ関連化学シンポジウム
  • [学会発表] ライゲーション反応とレポーター酵素再構成を利用したリガンド-タンパク質間相互作用の検出2019

    • 著者名/発表者名
      高橋剛、萩原弘顕
    • 学会等名
      第56回ペプチド討論会

URL: 

公開日: 2021-01-27  

サービス概要 検索マニュアル よくある質問 お知らせ 利用規程 科研費による研究の帰属

Powered by NII kakenhi