βサラセミア治療薬を目指すCHTOPを標的としたスプライシング阻害剤の探索

2018 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 18K05350
• 研究機関: 東京農工大学
• 研究代表者: 泉川 桂一 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 特任助教 (60625713)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: スプライシング / CHTOP / サラセミア / γグロビン / スクリーニング

研究実績の概要

本研究は、βサラセミアの新規治療法として有望視されるγグロビン再発現法の確立を目標とし、γグロビンの発現抑制因子であるCHTOPに着目したスプライシング抑制剤を介するCHTOPの発現抑制法を開発すること目的としている。
ヒト慢性骨髄白血病細胞株K562においてCHTOP発現低下時のγグロビン発現量の増減を検討した。電気穿孔法でのsiRNAによるCHTOPの発現抑制では、報告されているγグロビンの発現上昇が検出されなかった。赤芽球関連細胞でのCHTOP発現抑制時の効果を検証する必要があると考えられた。また、酪酸ナトリウムを用いたK562細胞の赤血球分化系を利用しCHTOP発現抑制時のヘモグロビン合成を検証した結果、CHTOPはヘモグロビン合成に影響を及ぼさないことが示唆された。次に、CHTOP pre-ｍRNAのスプライシングを感知するスクリーニング系の作製に着手した。CHTOPのmRNAはエクソン（Ex）１からEx６までで構成され、Ex２とEx３に挟まれたイントロン（Int）２がスプライシングされるとmRNAは正常に発現するが、スプライシング抑制によりInt2が残留すると、mRNA分解が誘導されCHTOPの発現量が低下する特徴がある。この特異なメカニズムを利用し、Int２のスプライシング抑制を促す薬剤を探索するためのスクリーニング系を考案した。NanoLucルシフェレースの遺伝子配列の上流にCHTOPのEx１、Ex2、Int2、Ex3、Ex4遺伝子領域を有するミニ遺伝子を構築し、これを用いたin vivoスプライシングアッセイにより、ミニ遺伝子に由来するリポーター（NanoLuc）の発現システムがCHTOPの発現量を示す指標として機能することを示し、CHTOP pre-ｍRNAに対するスプライシング抑制剤のスクリーニング系として利用可能であることを示した。

研究成果

• [国際共同研究] La Trobe Institute for Molecular Science(Australia)
  • 国名: オーストラリア
  • 外国機関名: La Trobe Institute for Molecular Science
• [雑誌論文] TDP-43 regulates site-specific 2'-O-methylation of U1 and U2 snRNAs via controlling the Cajal body localization of a subset of C/D scaRNAs. (2019)
  • 著者名/発表者名: Izumikawa Keiichi, Nobe Yuko, Ishikawa Hideaki, Yamauchi Yoshio, Taoka Masato, Sato Ko, Nakayama Hiroshi, Simpson RJ, Isobe Toshiaki, Takahashi Nobuhiro.
  • 雑誌名: Nucleic Acids Research 巻: 47 ページ: 2487～2505
  • DOI: 10.1093/nar/gkz086.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Modulating the expression of Chtop, a versatile regulator of gene-specific transcription and mRNA export. (2018)
  • 著者名/発表者名: Izumikawa Keiichi、Ishikawa Hideaki、Simpson Richard J、Takahashi Nobuhiro
  • 雑誌名: RNA Biology 巻: 15 ページ: 849～855
  • DOI: 10.1080/15476286.2018.1465795
  • 査読あり / 国際共著