| 研究課題/領域番号 |
18K05360
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| 研究機関 | 芝浦工業大学 |
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研究代表者 |
幡野 明彦 芝浦工業大学, 工学部, 教授 (10333163)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | チミジンホスホリラーゼ / 血管新生因子 / 蛍光団 / 過リン酸分解 / 反応転換率 / 癌細胞 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では，血管新生因子であるチミジンホスホリラーゼ（ＴＰ）の酵素活性に応答するプローブを開発し，癌細胞の初期進展過程の可視化を行う．
2019年度は，ＴＰの基質であるチミジンを基本骨格として蛍光団を塩基部位に導入したヌクレオシドを合成し，ＴＰによる過リン酸分解能を評価した。蛍光色素としては，ダンシル基をアルキルリンカーを介してチミジンの塩基部位に導入した。ダンシル基と塩基部位のリンカーの長さは炭素原子４つとした。この化合物を基質としてＴＰとの過リン酸分解反応をおこなったところ，1.0 mMリン酸緩衝液pH 6.8 では２％の反応進行が見られた。上記反応は懸濁系であったため，基質が水に溶解していないと考えられた。そこで，水と完全に溶解するジメチルスルホキシド（DMSO）を添加した。その結果，DMSO濃度を10から40％に増加して行くと過リン酸分解の効率が向上することがわかった。これは，基質が溶解して酵素ポケットに取り込まれる確率が上がったためである。それに対し，DMSOが50%以上では，徐々に活性は低下したことがわかった。
また，蛍光色素を有するウリジンをチミジンとの塩基部位交換反応も実施した。興味深いことに，塩基部位交換反応は過リン酸反応速度が分解反応よりゆっくりであることがわかった。
次に，リン酸緩衝液の濃度効果を調べた。こちらも興味深く，リン酸濃度がより低い方が反応転換率が向上することがわかった。過剰なリン酸は，基質，生成物を
以上の結果を踏まえ，蛍光色素を消光するような官能基の導入目指す。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
現在のところ，蛍光色素を有したチミジンアナログの合成と，そのアナログが過リン酸分解反応を受けることが証明できた。一つ問題点として，チミジンアナログを水に溶解するためにDMSOを添加せねば成らず，チミジンアナログの親水性化が必要なことがわかった。次の段階として，チミジンの5位に消光剤を導入し，チミジンホズホリラーゼの反応性を検討する。
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| 今後の研究の推進方策 |
チミジンアナログ分子として，5位水酸基を消光剤に変換合成を行なう。本変換合成により，蛍光色素と消光剤を同一分子に有することになる。すなわち，この分子には蛍光は無い。チミジンホルホリラーゼの過リン酸分解反応によって蛍光色素と消光剤の距離が離れると，蛍光が復活する。消光剤としては4,6ジニトロフェノール，ダブシル基を考えている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2020年の２，３月に実験を進めるために，試薬を多めに購入したため。
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