| 研究課題/領域番号 |
18K05384
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
吉見 啓 東北大学, 未来科学技術共同研究センター, 准教授 (60436102)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 糸状菌 / 菌糸接着 / 基質定着 / α-1,3-グルカン / ガラクトサミノガラクタン |
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| 研究実績の概要 |
多細胞の真核微生物である糸状菌（カビ）の細胞は細胞壁で覆われており、栄養基質への定着・侵襲には細胞壁成分を主とする細胞表層の物性が重要な鍵を握る。また、糸状菌を液体培養すると菌糸が絡まり菌糸塊を形成することは広く知られているが、その分子機構は全く不明である。申請者は、これまでに糸状菌における不溶性の細胞壁多糖α-1,3-グルカン（AG）と水溶性ガラクトサミノガラクタン（GAG）が菌糸接着因子であることを明らかにした。しかしながら、AGおよびGAG糖鎖の物理化学的性質と糖鎖間の相互作用に関しては全く不明である。本申請研究では、精製糖鎖を用いた糖鎖間の相互作用をin vitroで解析するとともに、麹菌においてAG及びGAG発現量を調節した株を用いたin vivo解析を行い、これらの比較解析により菌糸接着と基質定着の分子機構を総合的に理解することを目的とする。本目的を達成するため2018年度は以下の内容について研究を実施した。
AG糖鎖およびGAG糖鎖の精製：糸状菌細胞壁から不溶性多糖AGを精製する方法として、すでに熱水・アルカリ抽出法を確立している。今年度は、これをさらに改良し、2N NaOHで溶解したAGをアルカリ移動相を用いたゲル濾過カラムで分画する方法を確立した。これにより分子量分布の異なるAGを分画・精製することが可能となり、AG分子量と菌糸の凝集性の関連性が明らかになった。また、GAGは水溶性分泌多糖であるが、今年度研究において培地中に分泌されたGAGをEtOH沈殿により精製する方法を確立した。この際、EtOHを段階的に添加することにより、ほぼ純粋なGAGの抽出精製に成功し、GAG凝集性のin vitro解析が可能となった。さらに、精製したAGおよびGAGについてNMR分析あるいは加水分解物の構成糖分析を行い、AGおよびGAGが高純度に精製されていることが確認できた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究により確立したアルカリ移動相を用いたゲル濾過カラム法を用いて、モデル糸状菌Aspergillus nidulansの細胞壁AGを分画・分析したところ、AG分子量の違いによって菌糸の凝集性が異なることが明らかになった。本結果とこれまでの知見から、菌と基質との定着性や糖鎖間の相互作用には、AGの量だけでなくその分子量と空間配置が強く影響することが示唆された。本成果は、Frontiers in Microbiology誌、９巻 Article-2623（2018年）に掲載された。
また、EtOHを段階的に添加するGAG精製法を確立し、麹菌から水溶性分泌多糖GAGをほぼ純粋に抽出・精製することが可能となった。この精製GAGを用いて、菌糸の凝集性をin vitroにより評価したところ、GAGが菌糸接着因子であることがin vitroにおいても初めて実証された。本成果は、現在、Frontiers in Microbiology誌に投稿中である。
さらに、菌糸凝集や基質定着に関わる細胞壁構築機構に着目して阻害剤を探索したところ、糸状菌のPKC（細胞壁構築機構におけるキーたんぱく質）に特異的な阻害剤を発見した。本成果は、Applied and Environmental Microbiology誌、85巻10号（2019年）に掲載予定である（オンラインでは掲載済）。
以上のように、着実に本研究による成果が現れていることから、本研究はおおむね順調に進展していると言える。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度は、AG糖鎖およびGAG糖鎖の精製法を確立したことから、今後は以下の研究内容を展開する。
①糖鎖間分子間相互作用解析法の開発および糖鎖間、糖鎖-基質間の相互作用解析：(a)AG被覆粒子の作製～ 精製AGをアルカリDMSOに溶解し、そこに疎水性微粒子(蛍光ラテックス粒子)を投入し、さらに純水を加えて超音波処理した後、有機溶媒層から水層に移行する粒子をAG被覆粒子として回収する。AG被覆粒子に吸着しているAGを硫酸加水分解することでAGの粒子吸着量を決定する。(b)GAG被覆粒子の作製～ GAGはアミノ基を有する正電荷多糖であることから、カルボキシ基を有する微粒子を用いて静電相互作用で被覆する。GAG被覆量は、被覆粒子の加水分解時に遊離するガラクトサミン量を定量して決定する。(c)相互作用解析～ AG被覆粒子、GAG被覆粒子、AG粒子とGAG粒子の混合系を用いて、粒子の凝集量をその凝集体のサイズ分布として動的光散乱法(DLS)で計測・定量化する。栄養基質への定着能解析では様々な基質をミミックした基盤上（例：植物葉表面を模倣した疎水性ガラススライド、穀物顆粒を模倣した親水性プラスチック）に作製粒子を定着させ、洗浄強度を変化させて剥がれ落ちる粒子を蛍光強度により定量化する。
②麹菌AGまたはGAG発現量調整株を用いた菌糸吸着試験：AG-GAG二重欠損株は完全分散することから、二重欠損株にAG合成酵素またはGAG合成酵素の発現量を段階的に制御して、AG・GAG発現量制御株シリーズを造成する。それらの株の菌糸接着能を培養性状比較により評価する。また、これらの菌株の基質定着能を②と同様に評価する。②のin vitro吸着解析の定量結果と、in vivo解析の結果の対応を考察する。
以上を実施することで、菌糸接着と基質定着の分子機構を総合的に理解できると考えられる。
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