| 研究課題/領域番号 |
18K05388
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| 研究機関 | 信州大学 |
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研究代表者 |
小笠原 寛 信州大学, 学術研究院総合人間科学系, 助教 (30535232)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | Escherichia coli / Oxidative stress / Two-component system / HprS/R / hydrogen peroxide |
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| 研究実績の概要 |
令和元年度は当初計画通り、(1)ペリプラズム過酸化水素センサーHprSの活性化に関わる分子メカニズムの解明、(2) HprS/HprRホモログの進化と機能解明、(3)ペリプラズム領域において機能する新規酸化的損傷タンパク質修復機構の探索と機能解明を目指した。(1)については、平成30年度は構築した変異導入hprSライブラリーをhprS欠損hiuH-lacZレポーター株に導入後、X-gal入りLB寒天培地上にてHprS活性化に影響を与える変異体の取得を試みたが、コロニー色の違いによって、β-ガラクトシダーゼ活性値に大きな違いが確認出来なかったため、令和元年度は得られたコロニーをポイント打ちし、液体培養後にβガラクトシダーゼ活性の比較を行った。さらにHprSに保存される4つのCys残基への変異導入が、HprSホモダイマー形成へ与える影響について調査した。 (2)については、HprSホモログ間において、2つの膜貫通領域[TM1, TM2]におけるCysに特徴的な違いが確認された。中でも、近縁種の大腸菌とサルモネラ菌において、大腸菌はTM2に2つのCysを有しているが、TM1にCysを有しておらず、サルモネラ菌においてはTM1とTM2に一つずつのCysを有する違いが見られた。これらCysの位置がHprS機能に与える影響について明らかにするために、これらCysの位置情報を元に大腸菌HprSに変異を導入しサルモネラ型Cys配列を有するHprS変異体の機能解析を進めた。(3)については、H30年度に引き続きHprR結合コンセンサス配列をプロモーターに有する新規HprR標的候補遺伝子の発現解析を進め、さらに、HprRとDNA認識配列が重複するCusRの新規標的候補遺伝子についても調べ、それら遺伝子発現に対するHprRの影響について調べた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究概要の実績に示した令和元年度の当初計画(1)～(3)に沿って研究を実施した。(1)では平成30年度に構築した変異型hprSをアラビノース誘導プロモーター制御下で発現可能な変異導入hprSライブラリーを、hprS欠損hiuH-lacZレポーター株に導入後、液体培養後にβ-gal活性を測定したが、野生型HprS高発現プラスミド、およびC165A変異HprS高発現プラスミド導入株との顕著な違いを示す変異体の選抜はできなかった。また、Two-hybrid systemを用いてHprSの4つのCys残基への変異導入によるホモダイマー形成への影響について調べたが、野生型との顕著な差は見られなかった。令和2年度においてはそれぞれ過酸化水素存在下における解析を行う計画である。(2)については、大腸菌HprSと2つの膜貫通領域[TM1, TM2]に存在するCysの位置に特徴的な違いが確認されるサルモネラ型HprS(CopS)について、TM1のCysが高濃度過酸化水素応答に関与するかについて明らかにするために、大腸菌HprSに変異を導入し、サルモネラ型Cys配列を有するHprS変異体を作製した。現在、hprS欠損hiuH-lacZレポーター株に導入後、過酸化水素応答について解析を進めているところである。3)については、HprRと転写因子CusR が共通の標的塩基配列を認識し、遺伝子発現を制御することが我々の研究で明らかとなっていることから、CusRのGenomic SELEXデータを用いた新規標的候補遺伝子の探索を行い、これら遺伝子発現に対するHprS/Rの影響について調べるために、hprSR欠損株を用いた発現解析を実施している。
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| 今後の研究の推進方策 |
細菌のペリプラズム空間における酸化ストレスモニター機構、および酸化的損傷タンパク質修復機構の解明を目的として、令和2年度は(1)ペリプラズム過酸化水素センサーHprSの活性化に関わる分子メカニズムの解明、(2) HprS/HprRホモログの進化と機能解明、(3)ペリプラズム領域において機能する新規酸化的損傷タンパク質修復機構の探索と機能解明を目指し以下の研究を実施する。(1)については、過酸化水素存在下において、hprS欠損hiuH-lacZ株に変異導入hprSライブラリーを導入して行う網羅的レポーター解析、およびTwo-hybridシステムを用いたHprS間相互作用解析を行い、過酸化水素濃度変化がHprS-sfGFPの細胞内局在へ与える影響について調べる予定である。また、HprSの精製とプルダウンアッセイの実施、過酸化水素濃度依存的なHprSの構造変化について調べる計画である。(2)については、令和元年度に引き続き大腸菌HprSの2つの膜貫通領域[TM1, TM2]のうち、TM1へのCys残基の導入が高濃度過酸化水素応答に与える影響について調べ、サルモネラCopSについても過酸化水素応答への関与の有無を調べるための機能解析を進める計画である。(3)については、令和元年度に引き続きHprR標的候補遺伝子群について、これらプロモーターに対するHprRの結合の確認を含めた遺伝子発現解析を実施し、高濃度過酸化水素条件下において重要な役割を担う因子の特定、および機能解明を目指す。
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