| 研究課題/領域番号 |
18K05388
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| 研究機関 | 信州大学 |
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研究代表者 |
小笠原 寛 信州大学, 学術研究院総合人間科学系, 助教 (30535232)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | Escherichia coli / Oxidative stress / Two-component system / HprS/R / H2O2 |
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| 研究実績の概要 |
R2年度は当初計画通り、(1)ペリプラズム過酸化水素センサーHprSの活性化に関わる分子メカニズムの解明、(2) HprS/HprRホモログの進化と機能解明、(3)ペリプラズム領域において機能する新規酸化的損傷タンパク質修復機構の探索と機能解明を目指した。(1)については、H2O2に比べ、顕著なhiuH発現誘導効果を示した次亜塩素酸ナトリウム存在下におけるHprS活性化に関わる機能部位について調査した。HprSの4つのCys残基以外に、6つのMet残基にも着目し、それぞれAla変異を導入した変異導入HprS発現プラスミドを構築し、HprS活性化に影響を与えるアミノ酸残基の探索を試みた。さらにH2O2添加時におけるBacteria Two-hybridシステムを用いたHprSホモダイマー形成の確認を行った。(2)については、H31年度に引き続きHprSホモログの2つの膜貫通領域[TM1, TM2]に保存されるCys残基のうち、大腸菌HprSには存在しないTM1のCysの役割について明らかにするために、TM1にCysを有するSalmonella Typhimuriumの配列情報を元に作製された大腸菌HprSのサルモネラ型Cys変異体の機能解析を進めた。(3)については、H31年度に引き続きGenomic SELEX解析データとHprR結合配列から予測されたHprR標的候補遺伝子群のうち、機能未知酸化還元酵素をコードする遺伝子群の発現解析や、ペリプラズム領域タンパク質のジスルフィド結合導入に関わる因子のHprR標的遺伝子発現への関与について明らかとするために関連遺伝子群の欠損株を用いた遺伝子発現解析を実施した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究実績の概要に示したR2年度の当初計画(1)～(3)に沿って研究を実施した。(1)では部位特異的変異導入法により大腸菌HprSの4つのCys残基、6つの開始コドン以外のMet残基がそれぞれAlaに置換された変異型HprSの高発現プラスミドを作製し、それぞれhprSを欠損した大腸菌hiuH-lacZレポーター株に導入後、次亜塩素酸ナトリウム存在下におけるhiuHプロモーター活性値の変化を指標に比較検討を行い、幾つかのメチオニン残基において顕著な影響が確認された。H31年度に引き続きhprS欠損hiuH-lacZレポーター株にランダム変異導入HprS高発現プラスミドを導入することで、hiuH発現に影響を与える新規HprSアミノ酸残基の特定を試みたが、本手法においてhiuH発現を顕著に変化させるHprS変異体の取得には至らなかった。また、Bacteria Two-hybridシステムを用いた解析において、H2O2添加の有無によるHprS-HprS間の相互作用は確認されなかった。(2)については、大腸菌HprSの膜貫通領域TM1には存在しないCysを導入し、H2O2応答に関与することが明らかとなっているC165をSerに置換したサルモネラ型Cys変異体(G22C/C165S)を野生型HprSの代わりに発現させた株について、次亜塩素酸ナトリウム添加後30分におけるhiuH発現誘導効果は大腸菌野生型HprSと同等であった。一方、C165のみをSerに置き換えたCys変異体(C165S)の次亜塩素酸添加後30分のhiuH発現誘導は著しく減少した。3)については、HprR標的候補のうち機能未知酸化還元酵素をコードする3種の遺伝子について転写解析を進めており、ペリプラズム領域タンパク質のジスルフィド結合導入に関わる因子について、著しいhiuH発現抑制効果を示すことを見出した。
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| 今後の研究の推進方策 |
細菌のペリプラズム空間における酸化ストレスモニター機構、および酸化的損傷タンパク質修復機構の解明を目的として、R3年度も引き続き(1)ペリプラズム過酸化水素センサーHprSの活性化に関わる分子メカニズムの解明、(2) HprS/HprRホモログの進化と機能解明、(3)ペリプラズム領域において機能する新規酸化的損傷タンパク質修復機構の探索と機能解明を目指し以下の研究を実施する。(1)については、R2年度に引き続きCysおよびMet残基を中心に、HprS活性化に影響を与えるアミノ酸残基の機能解明を進め、HprSの自己リン酸化能への影響、およびHprS-HprS間相互作用の解析を行う。HprSのC末端とGFPを融合させ、H2O2や次亜塩素酸ナトリウム添加時のHprSの大腸菌における細胞内局在について調べる。(2)については、大腸菌HprSのサルモネラ型Cys変異体において次亜塩素酸ナトリウム添加時の発現誘導が確認されたことから、TM1に導入したCysの位置を一つずつずらした変異体を作製し、細胞内膜上におけるCysの位置がHprS活性化に与える影響についても確認する計画である。また、サルモネラ菌のHprSホモログCopSの活性化機構の解明、およびサルモネラ菌におけるCopS/CopRの機能解析については、次年度実施する計画である。3)については、R2年度に引き続きHprR標的候補のうち、機能未知酸化還元酵素をコードする3種の遺伝子の発現制御機構と機能的役割について明らかにし、HprS/HprR発現制御に関与することが示唆されたペリプラズム領域タンパク質のジスルフィド結合導入に関わる因子による、HprS制御の分子機構を明らかにする。
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