| 研究課題/領域番号 |
18K05389
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
土屋 徹 京都大学, 人間・環境学研究科, 准教授 (20362569)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | シアノバクテリア / クロロフィルd / 光合成 / 遠赤色光 / ゲノム編集 |
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| 研究実績の概要 |
昨年度に引き続き、Acaryochloris marinaでのゲノム編集技術の開発を進めた。これまでに、多くのバクテリアで保持されることが知られている広宿主域プラスミド由来のベクターを用いて、ヌクレアーゼであるCpf1（Cas12a）タンパク質の遺伝子をA. marinaへ導入することには成功していたので、さらに標的配列にCpf1を導くcrRNAの発現カセット、相同組換えの鋳型となるホモロジーアームの導入を試みた。条件検討の結果、Cpf1遺伝子、crRNA発現カセットおよびホモロジーアームをプラスミドで保持したA. marinaの形質転換体を作製することができた。この実験では、光化学系複合体のサブユニットの一つにヒスチジンタグを融合することを目的としたため、得られた形質転換体の当該領域の塩基配列を解析し、企図したとおりにゲノムが編集されていることを確認した。また、このゲノム編集株から調製したタンパク質をもちいてウェスタンブロッティングを行ったところ、ヒスチジンタグを検出することができたことから、標的とするA. marinaの内在タンパク質にヒスチジンタグが付加されていることが判明した。さらに、本ゲノム編集株からのヒスチジンタグを利用した光化学系複合体のアフィニティー精製による単離の検討を開始した。A. marinaでのゲノム編集技術を確立したことにより、内在タンパク質へのタグの付加以外にも、遺伝子破壊による逆遺伝学的解析も可能となったといえる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は、A. marinaでのゲノム編集技術の開発に成功したという大きな進展が見られた。これまでに遺伝子操作等が容易な、いわゆる「モデル生物」として利用されるシアノバクテリアではゲノム編集に成功した論文がいくつか存在していたが、非モデルシアノバクテリアであるA. marinaでのゲノム編集の成功は、他の多くの非モデルシアノバクテリアでの本技術の適用に道を拓く成果である。本研究課題を推進するための基盤となる技術が確立したといえるので、次年度は作出したゲノム編集株の解析と新たな標的のゲノム編集株の作製を進めてゆくことができる。
以上を鑑みて、現在までの達成度は「おおむね順調に進展している」とした。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の研究は、開発に成功したA. marinaでのゲノム編集技術を利用した研究に注力する。具体的には、光合成に関与する遺伝子群の破壊などを開始する。また、光化学系複合体のサブユニットにヒスチジンタグを導入したゲノム編集株からの光化学系複合体の単離を試みる。さらに、開発を続けているCRISPR干渉のA. marinaへの適用も進める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度は、A. marinaでのゲノム編集技術の確立には成功したが、当該生物がモデルシアノバクテリアと比較して培養により時間を必要とすることが律速となっている。その結果、当初の計画から進展が遅れてしまったため、未使用額が生じることになった。
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